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上海慧穎生物科技有限公司

葡聚糖凝膠柱的使用方法

時間:2015-1-27閱讀:3973

葡聚糖凝膠柱的使用方法:

(1) 預處理
稱取Sephadex G-25(50-100目)約5g,加入蒸餾水100ml,置室溫下3h進行溶脹。
(2) 裝柱
凝膠層析柱的直徑與柱長之比一般為1:15。柱的底部用裝有細玻璃管的橡皮塞塞緊,用洗凈的玻璃絲(約200目尼龍布)墊底或購買類似規格的商品柱。然后將柱垂直安裝好,先加入1/3柱體積蒸餾水,接著將溶脹好的凝膠邊攪勻邊連續裝入,使它們在柱內自然沉降。同時大開下口慢速流出蒸餾水。裝柱后的凝膠必須均勻,不能有氣泡或明顯條紋。否則,必須到出重裝,裝好后,用蒸餾水平衡2-3h即可加樣品分離。

(3) 加樣

加樣前,首先把柱內凝膠上面多余的蒸餾水放出,直到柱內液面與凝膠表面相齊(或留一極薄液層)為止。然后,由柱的上端加水解液2ml,注意不要讓溶液把凝膠沖松浮起,加完樣品后,打開下口緩慢放出液體至液面與凝膠面相齊,再用少量蒸餾水沖洗原來盛樣品的容器2-3次,待全部進入層析柱后,即可進行洗脫。
(4) 洗脫與收集
洗脫時,用蒸餾水作洗脫劑,并且要連續不斷地進行,使凝膠柱上端保持一定的液層,防止凝膠柱表面的液體流干。本實驗洗脫液流出的速度應控制在0.8-1.0ml/min。洗脫液的收集采用分管連續順序收集,每管收集3ml,共收集10管。據經驗,4或5號管核苷酸濃度zui大,可作為層析鑒定的樣品液。但因層析柱長度的差異,管號會有變化,必要時可用紫外檢測A260nm,找出濃度zui大的管號。
(5) 凝膠的再生和回收
凝膠柱使用一次后,必須反沖疏松一次,平衡后再使用。若使用數次,就需要再生處理。用0.1mol/L NaOH-0.5mol/L NaCl溶液浸泡,然后用蒸餾水洗至中性備用。若實驗完畢,將再生后的凝膠在布氏漏斗上用蒸餾水洗滌抽干,再用95%乙醇洗兩次,在60℃烘箱中烘干,回收保存。

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