聯系電話
上海北諾生物科技有限公司
中級會員·14年
- 聯系人：
- 周經理 劉經理
- 電話：
- 021-57730393
- 手機：
- 15800960770
- 傳真：
- 86-021-61496710
- 地址：
- 上海市徐匯區宜山路520號中華門大廈18樓D座
- 個性化：
- www.bnbiotech.com
掃一掃訪問手機商鋪
利用聚合酶鏈式反應（PCR），任何兩個DNA片段可連接成一個新的重組DNA分子。通過在PCR引物中引入的額外非同源的核苷酸，可在連接處產生所需要的讀碼框架或酶切位點。用該技術并不需要知道待亞克隆的DNA的核苷酸序列，只需要知道兩小段伸展于片段兩倆的區段作為擴增反應的引物結合區。
實驗方法
- 基本方案
| 實驗材料 | DNA |
|---|---|
| 試劑、試劑盒 | TE 無水乙醇 DNA聚合酶 CTP |
| 儀器、耗材 | 電泳儀 離心機 PCR儀 |
| 實驗步驟 | 1. 制備模板DNA，如DNA不是經氯化銫梯度純化的，100℃煮沸10 min 以滅活核酸酶。 2. 制備寡核苷酸引物，若PCR產物要進行平端克隆，就應該對引物的5’端羥基進行磷酸化處理。  圖一、用PCR反應引入單一的酶切微點和產生符合讀碼框架的融合蛋白。 3. 建立標準的擴增反應，以礦物油覆蓋表面，在以下條件下進行20~25輪擴增循環：94℃變性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸3 min，zui后一個循環在72℃延伸10 min 盡可能使擴增產物完整。  圖二、序貫PCR法構建重組DNA分子，引物1b與基因2同源區域；引物1c有與基因1同源區域 4. 取少量反應混合物（4~8 μl），用瓊脂糖凝膠電泳或聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測擴增效果。 5. 吸去礦物油上層，用氯仿抽提1次除去殘存的礦物油，用飽和酚抽提1次，然后用無水乙醇沉淀DNA。  圖三、用反向PCR插入酶切位點 6. 4℃高速離心10 min，沉淀用20 μl TE緩沖液溶解。 7. 用玻璃珠，電冼脫或低融點膠的酚抽法進一步純化PCR產物可去除未摻入dNTP引物、無關的PCR產物和模板DNA。 8. 對于通過平端連接進行的克隆：用DNA聚合酶I （或klenow酶）修平擴增片段的3‘末端。 9. 對于通過粘端連接進行的克隆：在20 μl 體積用合適的酶消化一半PCR只產物，用過量的酶消化數小時。 10. 用合適的末端互補的酶在20 μl 體積內消化0.2~2 μg 載體DNA，用CIP去瞵酸化，以阻止載體自連。 11. 用普通瓊脂糖或低融點瓊脂溏電泳分離線性化的載體。 12. 用玻璃珠、電洗脫、或酚抽法回收線狀的載體。 13. 連接PCR片段和線狀載體。 14. 取部分連接產物轉化大楊桿菌，從轉化體集中以小量制備法提取質粒DNA。 15. 用合適的酶消化轉化體的質粒DNA，以瓊脂糖凝膠電泳分析以確證片段的插人。 16. 測定質粒DNA中擴增片段的序列，檢查有無突變，或者用生物化學或遺傳學方面的功能分祈篩選轉化體。 |
