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如果同一標(biāo)本中需要同時顯示A、B兩種抗原，則A抗原的抗體用FITC標(biāo)記，B抗原的抗體用TRITC標(biāo)記，可采用以下染色方法用過的：

免疫熒光細(xì)胞化學(xué)雙染

原代培養(yǎng)的大鼠端腦細(xì)胞第14天胚胎：在成骨形態(tài)蛋白的誘導(dǎo)下，乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶（綠色熒光）和同源結(jié)構(gòu)域蛋白Islet-1（紅色熒光）共存于細(xì)胞質(zhì)中（激光掃描共存）。聚焦顯微鏡觀察）

1.一步雙染法，將兩種熒光標(biāo)記抗體按適當(dāng)比例（A+B）混合，按照直接法進(jìn)行染色。

2.兩步雙染法，先用TRITC標(biāo)記的抗體A進(jìn)行免疫熒光染色，然后用FITC標(biāo)記的抗體B進(jìn)行免疫熒光染色。根據(jù)兩種抗體的動物種類，可以采用直接法或間接法。結(jié)果是A抗原呈橙紅色熒光，而B抗原呈黃綠色熒光。在應(yīng)用中，常用的方法是免疫熒光組織化學(xué)中的間接法與熒光染料SABC-Cy3法的結(jié)合。例如，在實驗設(shè)計中，選擇小鼠抗大鼠A和兔抗大鼠B作為兩種不同的特異性一抗，匹配的二抗分別為FITC-抗小鼠IgG和生物素化抗兔。免疫球蛋白G。

進(jìn)行雙染時，由于兩種一抗來源不同，可能會混合一抗。孵育后，清洗未結(jié)合的一抗。滴加二抗時，先加入人生物素化抗兔IgG（二抗）孵育。清洗后，滴下 SABC-Cy3 復(fù)合物。特異性熒光，然后與FITC-抗小鼠IgG（二抗）孵育，最后封片觀察。結(jié)果，A抗原顯示綠色熒光，B抗原顯示紅色熒光。

該方法中需要注意的是，兩種一抗混合稀釋時，抗體的終濃度應(yīng)為每種抗體的工作濃度。也就是說，混合液要同時滿足兩種一抗的工作濃度。如果兩個一抗來自同一物種，則必須進(jìn)行兩次雙染，即A抗原先用第一個一抗和第一個熒光二抗染色，然后用第二個一抗和第一個熒光二抗洗滌熒光二抗。 B抗原染色需使用兩種熒光二抗，否則會發(fā)生交叉反應(yīng)，導(dǎo)致染色不特異。