PriCells: 正常人角膜上皮細胞和干細胞的分離

實驗材料：
1. 完整的人角膜；
2. GMF-Saline G；
3. 中性蛋白酶Ⅱ，1.2U/ml（用DMEM/F12/GASP稀釋2.4U中性蛋白酶Ⅱ）；
4. 胰蛋白酶/EDTA；
5. DMEM/F12/GASP；
6. DEME/F12/2FB/GASP：DMEM/F12/GASP含2%FBS；
7. CMF/GASP；
8. LSC培養(yǎng)基；
9. 彎虹膜剪，11cm（4-3/8in）；
10. Jeweler’s鑷，10cm（4in）；
11. 角膜剪，19mm刃，尖頭；
12. Colibri縫紉鉗，0.1mm；

實驗方法：
1. 清洗角膜3×5min；
2. 剪除殘留的鞏膜，結膜和虹膜；
3. 加入2ml中性蛋白酶Ⅱ，4℃過夜，輕微攪動；
4. 將加入中性蛋白酶Ⅱ的角膜放入4℃搖床搖30min；
5. 用DMEM/F12/GASP清洗角膜；
6. 解剖顯微鏡下，小心去除角膜中央的上皮細胞（此時多數(shù)的中央上皮細胞已經(jīng)剝脫）并除去角膜緣包含有Vogt柵欄區(qū)的色素上皮細胞；
7. 用胰蛋白酶/EDTA消化角膜緣上皮細胞片37℃，10min；
8. 加入等體積DMEM/F12/2FB/GASP；
9. 400g離心10min，棄上清；
10. 用DMEM/F12/2FB/GASP洗一遍，離心，棄上清；
11. 加入LSC培養(yǎng)基，將細胞拍散并用血細胞計數(shù)板計數(shù)；
12. 將細胞以1×10⁴/cm²的密度接種至鋪有3T3飼養(yǎng)層的組織培養(yǎng)皿或準備好的人羊膜上；
13. 每三天更換一次培養(yǎng)基；
14. 當細胞達90%匯合時用胰蛋白酶消化傳代：