核酸雜交技術是較早的應用于病原微生物的檢測技術。因其操作步驟比較煩瑣，現在在動物檢驗檢疫中應用較少，但是它是其他一些核酸檢測技術的基礎。它的基本步驟如下。
首先，制備一段寡核苷酸，其序列對應于被測病原微生物某段特異性核酸序列，在此寡核苷酸上進行適當的標記，作為檢測用探針。

然后，從樣品中提取核酸，對此核酸進行變性處理后固定在固相載體上，這些核酸變性處理后多數以單鏈的形式存在，因此它們能夠利用堿基互補原理，結合并固定探針，由于借助探針上標記的物質可以了解到是否有探針，甚至有多少探針被固定上去，再由此推知樣品中是否含有及甚至含有多少病原微生物。

上述是zui常用的固相雜交大致過程，除此之外還有液相雜交以及用于研究的細胞內定位（原位）雜交模式。新近發展的核酸芯片技術實際上也是一類核酸雜交技術。

就固相雜交而言，又可分為斑點雜交和凝膠電泳印跡轉移雜交。斑點雜交是直接將標本點在固相載體上雜交，該法迅速簡單，一次可檢測大量標本；凝膠電泳印跡轉移雜交是電泳技術和雜交技術結合的一種方法，根據雜交核酸的不同，又可分為Southern印跡法（檢測DNA）及Northern印跡法（檢測RNA）。傳統的固相載體多應用硝酸纖維膜和尼龍膜，近年來發展的微孔板包被技術以微孔板為載體取得了良好的效果。

探針標記物有放射性核素與非放射性物質兩種。放射性核素標記敏感性高，可檢測出pg水平的核酸，但因不易長期保存，且存在放射性污染等問題，現已較少應用。非放射性物質常用的有生物素、地高辛等，非放射性探針安全、穩定、操作方便并且經濟，但敏感性較低，近年來，由于雜交信號檢測方法的改進，檢測的敏感性得到了很大提高。