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熒光成像 失敗原因與成功訣竅
生物成像
熒光顯微鏡的使用需要很多專業(yè)技術(shù)，若要全部掌握需要花費大量的時間。但是，只要掌握觀察時的基本拍攝方法及基礎性的要點，即使不熟悉熒光顯微鏡原理，也能夠獲得準確的實驗數(shù)據(jù)。下面，基于熒光成像中容易陷入失敗的案例，總結(jié)在短時間內(nèi)高效拍攝的要點。
何謂熒光成像
熒光成像失敗事例1：對焦失敗
熒光成像失敗事例2：熒光信號過暗，對比度不足
熒光成像失敗事例3：熒光發(fā)生淬滅，細胞活性下降
何謂熒光成像
熒光成像（Fluorescence imaging）是指，對無法直接觀察的無色透明的細胞器官或特定蛋白質(zhì)，通過熒光標記試劑或熒光抗體進行熒光標記從而實現(xiàn)可視化的手法，由此能夠?qū)毎虻鞍踪|(zhì)的形態(tài)或結(jié)構(gòu)、生命活動進行觀察與分析。
熒光試劑或抗體經(jīng)過特定波長光（激發(fā)光）的照射后具有發(fā)光特性，通過熒光顯微鏡或激光共焦顯微鏡進行觀察。
從可進行活細胞的實時觀察到分子級別或細胞級別各種各樣的實驗，大量的生物實驗均基于熒光顯微鏡的使用。另一方面，使用熒光顯微鏡進行分析或評價的結(jié)果會因選擇的相機、物鏡以及光源等的不同而產(chǎn)生差異。
熒光成像失敗事例1：對焦失敗
對焦是顯微鏡的重要的基本操作。通過觀察準確的焦平面圖像才能進行準確的實驗評價，圖像（Figure）的品質(zhì)有時甚至左右論文能否受到認可。首先，說明拍攝對焦準確的清晰圖像拍攝的要點。
要點1：確認使用的物鏡是否合適
要進行顯微鏡觀察必須了解觀察目的與物鏡特性是否相符。尤其在熒光觀察中重要的是數(shù)值孔徑（NA），數(shù)值孔徑越大，越能獲取明亮，正常情況下，數(shù)值孔徑越大分辨率也越高，可獲取精細的圖像，但在另一方面，景深（Depth of Field：DOF）則變淺，被攝物體的可視對焦范圍變窄。除此以外，物鏡亮度或觀察距離也需要考慮，這些特性間的相關關系如下圖所示。
一般物鏡特性
| 分辨率 | NA | 觀察距離 | 景深 | 亮度 |
|---|---|---|---|---|
| 高 | 大 | 短 | 淺 | 亮 |
| 低 | 小 | 長 | 深 | 暗 |
另外還有需要蓋板玻璃校正*1及校正環(huán)調(diào)整*2的物鏡、專用于特殊觀察方法的光學設計物鏡等各種各具特點的物鏡*3。根據(jù)觀察方法選擇合適的物鏡尤為重要。
*1 蓋板玻璃校正：
蓋板玻璃校正物鏡設有蓋板玻璃校正值。正常情況下，蓋板玻璃使用0.17 mm，塑料培養(yǎng)皿為1.2 mm，不使用蓋板玻璃時使用0 mm物鏡。
*2 校正環(huán)調(diào)整：
高倍率物鏡中還有外殼部分帶有校正環(huán)（類似表盤）的部件。根據(jù)蓋板玻璃的厚度調(diào)整校正環(huán)，分辨率可變化數(shù)倍，使用前請務必確認校正環(huán)的狀態(tài)。
*3 物鏡的特點：
按照觀察方法，有時需要符合觀察方法的特定光學設計物鏡。包括相差、微分干涉、偏光、熒光、油鏡等。請確認物鏡種類。
要點2：從低倍率向高倍率調(diào)整物鏡
要點3：由近及遠查找焦點位置
熒光成像失敗事例2：熒光信號過暗，對比度不足
在熒光成像中重要的是獲取目標熒光分子或熒光蛋白質(zhì)的信號清晰可見的圖像。為此，重要的不僅是物鏡，還有與相機或濾光片、光源等各種單元的組合，如果組合構(gòu)成失敗，會使圖像的熒光信號過暗、對比度過低，從而難以觀察。下面，說明獲取清晰圖像所需掌握的要點。
要點1：使用適合觀察的相機
相機也有很多種類，下面介紹廣泛用于熒光顯微鏡的CCD相機的特點。
熒光觀察中重要的是S/N比（信號與干擾的比率）足夠高，因此在下表中合適的是黑白制冷CCD相機。
| 彩色 | 黑白 | |
|---|---|---|
| 非制冷 |
|
|
| 制冷 |
|
|
*1 可見光：
一般是指波長大約為400至700 nm的光。彩色相機的顯示與人眼相同，會切斷波長長度700 nm以上的光。因此無法觀察。
*2 暗電流和制冷：
CCD相機內(nèi)部在沒有輸入光的狀態(tài)下也會產(chǎn)生叫作“暗電流”的信號，是造成干擾的原因。曝光時間越長受光元件的溫度越高，干擾也變大，通過冷卻相機可抑制干擾。
要點2：使用調(diào)節(jié)亮度功能
亮度調(diào)節(jié)功能有多種，在相機設定中主要的調(diào)節(jié)方式是以下3個項目。理解這些特點并熟練地區(qū)分使用對熒光成像非常重要。
曝光時間
快門處于開啟的時間。為在此期間積蓄信號，曝光時間越長亮度越高，同時暗電流干擾也會累積從而干擾增多。
增益
對輸入CCD元件的電信號進行電性放大。但是，放大輸入信號后，干擾也會同時被放大。分辨率不因增益值而變化。
Binning（像素融合）
將臨近的像素視為1個假想像素，提高每個單位像素的接收信號量的功能。由于像素被合并圖片整體的像素數(shù)減少，分辨率將下降，但不會增加干擾。
要點3：熒光濾光片與試劑的匹配
即使熒光信號明亮而發(fā)光，如果濾光片透過率過低，仍無法充分觀察信號。重要的是盡量使用透過率高的濾光片。
熒光濾光片由激發(fā)濾光片與吸收濾光片、二向色鏡共3部分組成。確認激發(fā)濾光片是否與試劑的激發(fā)光譜重疊，吸收濾光片是否與試劑的熒光光譜重疊。假設加入濾光片上標注470/40時，表示可涵蓋470nm±20nm的波長范圍。數(shù)值數(shù)據(jù)難以理解時，觀察試劑與濾光片的光譜數(shù)據(jù)來判斷是否匹配。各種試劑或濾光片的光譜數(shù)據(jù)可通過各廠商的網(wǎng)站等確認。
要點4：物鏡的選擇
熒光信號偏弱，或?qū)Ρ榷炔蛔銜r，可通過更換NA值更大的物鏡，以便更明亮地觀察。 NA值越大，越能夠明亮地觀察熒光信號。物鏡的倍率越高，NA值也趨于變大，S/N比的上升不夠理想時，通過使用倍率更高的物鏡也可解決問題。
要點5：光源的選擇
有些光源沒有發(fā)出要觀察的波長。需要確認使用的光源，了解光源的特點并區(qū)分使用。
相比于水銀燈或金鹵燈是1種光源包含短波長到長波長的大范圍波長，激光或LED是1種光源只發(fā)出特定范圍的波長，因此需要將多個光源組合使用。信號無法順利發(fā)光時，確認試劑與光源波長的光譜數(shù)據(jù)。
熒光成像失敗事例3：熒光發(fā)生淬滅，細胞活性下降
發(fā)生淬滅或細胞活性下降的原因大多在于激發(fā)光導致的損傷。即使是瞬間，只要照射強烈的激發(fā)光，就會出現(xiàn)淬滅現(xiàn)象，細胞也會因光毒性影響而導致活性下降。為了防止此類現(xiàn)象，首先需要盡量“降低激發(fā)光強度”。但是，即使降低了激發(fā)光的強度，若長時間照射激發(fā)光，熒光信號仍會衰減直至淬滅，細胞將逐漸累積損傷最終失去活性。因此，降低激發(fā)光強度的同時，“縮短激發(fā)光照射時間”是防止激發(fā)光對實驗影響的重要兩點。
要點1：激發(fā)光強度下降
降低激發(fā)光強度，熒光就會相應地變暗，因此需要提高相機增益或延長曝光時間。但是，提高增益或延長曝光時間，就會增大暗電流的干擾，S/N比變低。
要在抑制淬滅及損傷的同時拍攝S/N比高的圖像，需要盡量使用靈敏度高的相機。
要點2：縮短激發(fā)光照射時間
要縮短激發(fā)光照射時間，需要降低基本的操作時間，因此盡量縮短對焦時間、信號查找所用的時間、設定曝光時間所用的時間等操作所用的時間。
另外，對于手動控制激發(fā)光快門開閉的顯微鏡類型，可能發(fā)生忘記關快門而造成長時間持續(xù)照射激發(fā)光，導致淬滅。因此拍攝結(jié)束后或臨時停止觀察時，及時關閉快門尤為重要。
熒光顯微成像系統(tǒng) 產(chǎn)品目錄
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