當目標分析物太小而不能用兩種抗體有效地夾住時，可采用競爭性法ELISA。競爭法ELISA適用于確定小分子的濃度，如前列腺素、cAMP、一氧化氮、皮質醇等。

該法也是將捕獲抗體包被在微孔板上。與夾心法ELISA不同的是，該法不使用標記的檢測抗體，而是使用標記的抗原。標記的抗原可與樣本中的目標抗原競爭性結合捕獲抗體。樣品中存在的抗原越多，能夠與捕獲抗體結合的標記抗原就越少。加入底物并產生信號，信號值與樣品中存在的蛋白量成反比。

競爭法ELISA雖然適用于小分子抗原的檢測，但它也存在一些缺點：

1. 靈敏度相對較低：相比雙抗體夾心法，競爭法的靈敏度通常較低。這是因為信號強度與待測抗原濃度呈負相關，低濃度抗原的信號變化可能不容易被檢測到。

2. 標準曲線范圍較窄：競爭法的標準曲線通常呈S形，線性范圍較窄，需要仔細優化實驗條件才能獲得準確的結果。

3. 操作較為復雜：競爭法的操作步驟相對較為復雜，需要精確控制抗原、抗體和標記物的濃度，以及孵育時間和洗滌條件。

4. 容易受到干擾：競爭法容易受到樣本中其他物質的干擾，如類風濕因子、交叉反應物質等，這些物質可能會影響抗原-抗體結合，導致結果偏差。因此，需要進行適當的質控和驗證，以確保結果的可靠性。

競爭法ELISA試劑盒的檢測步驟：

1. 包被抗體固定：首先，將捕獲抗體固定在微孔板上，這種抗體能特異性地結合待測抗原。

2. 加入樣品和標記抗原：在每個微孔中加入待測樣品和已知濃度的酶標抗原的混合液。

3. 孵育：讓樣品中的抗原與固相捕獲抗體結合，同時酶標抗原也在競爭結合這些位點。

4. 洗滌：去除未結合的抗原和酶標抗原，以減少背景信號。

5. 加入酶標二抗（如果適用）：在一些競爭法中，可能需要加入酶標二抗來檢測結合的酶標抗原。

6. 第二次洗滌：進一步清除未結合的酶標二抗，保持高特異性。

7. 顯色底物：加入酶的底物，形成顏色變化或熒光信號。

8. 讀取結果：通過酶標儀在特定波長下讀取吸光度值，通常在450nm。樣品中待測抗原的濃度與信號強度呈反比。

9. 建立標準曲線：使用已知濃度的標本建立標準曲線，以量化樣品中的待測抗原。

通過這些步驟，競爭法ELISA可以有效地區分樣品中抗原的濃度，即使在復雜或低純度的樣本中也能得到可靠的定量結果。