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為何你的平板“空空如也”？感受態細胞轉化的這幾個小細節你注意到了嗎？2025/04/09

1.前言在分子克隆實驗中，感受態細胞轉化是基因克隆的基礎步驟之一。但相信很多同學在涂板后，常常會出現平板上菌落稀少甚至“空空如也”的尷尬局面，這不僅耽誤我們的實驗進度，還會消耗寶貴的試劑和時間。實驗為何會卡在這一步？本篇文章，將從幾個關鍵環節入手，一起和大家好好探討一下這個問題。2.感受態細胞“不給力”感受態細胞的轉化效率直接決定了實驗成敗。如果細胞本身質量不佳，后續操作再完好也無濟于事。例如感受態細胞經常反復凍融或長期儲存（超過6個月），則很有可能會導致其活性顯著下降。感受態細胞是非常脆弱的，

細胞凋亡-早期凋亡檢測的優選2025/04/08

Annexinv-PE/7-AADApoptosisDetectionkit-早期凋亡檢測的優選紅色熒光標記可與綠色熒光實現共染適用范圍:懸浮細胞、貼壁細胞保存條件：2-8°C保存產品概述在正常細胞中，磷脂酰絲氨酸（PS）只分布在細胞膜脂質雙層的內側，而在細胞凋亡早期，細胞膜中的Ps由內側翻向外側。Annexinv是一種35-36KDa的ca2r依賴性磷脂結合蛋白,與Ps具有高度親和力,因此Annexinv被認為檢測細胞早期凋亡的靈敏指標之一。使用藻紅蛋白(PE)標記的Annexinv作為探針,

細胞凋亡-更亮、更穩定的紅色熒光2025/04/08

抗淬滅因子高活性重組TdT酶,保證熒光摻入效率適用范圍:細胞樣品、石蠟切片、冰凍切片保存條件：-20°C保存；BrightRedLabelingMix避光儲存于-20°C產品概述本試劑盒采用TUNEL(TdTmediatedduTPNickEndLabeling)法,在TdT酶的催化下在凋亡細胞斷裂DNA的3'-羥基(3'-OH)末端催化摻入四甲基羅丹明-脫氧三磷酸尿苷(TMRred-duTP)。試劑盒對標記反應進行了優化,采用最佳比例的TMRred-duTP和未標記的dNTP進該"標記尾巴減少

細胞凋亡--綠色熒光檢測凋亡2025/04/08

TUNELFITCApoptosisDetectionKit綠色熒光檢測凋亡綠色熒光標記適用范圍：細胞樣品、石蠟切片、冰凍切片保存條件：-20°C保存；FITC-12-dUTPLabelingMix避光保存產品概述細胞凋亡的一個顯著特點是染色體DNA被內源性核酸內切酶有規律的降解成長度約為180bp~200bp的整數倍片段。本試劑盒采用TUNEL(TdTmediatedduTPNickEndLabeling)法,用最佳比例的FITC-12-duTP和未標記的dNTP進行3'-OH末端的核苷酸摻入

細胞死亡的三種方式以及倆種凋亡細胞的檢測方法（Tunel、Annexin V）2025/04/01

細胞死亡動物細胞的死亡主要有三種方式：細胞凋亡、細胞壞死和細胞自噬。目前對動物細胞凋亡的特征、機制和生物學功能的研究較為深入。細胞凋亡也被稱為程序性細胞死亡(programmedcellDeath,PCD)。PCD最初是發育生物學中提出的概念,其含義是發育過程中發生的某類細胞的大量死亡,而這種細胞死亡要求特定的基因表達。細胞凋亡的典型特征是DNA規律性斷裂為180-200bp整數倍的片段,并暴露出3'-OH末端,在瓊脂糖凝膠電泳時呈現有規律的梯狀條帶。細胞壞死是區別于細胞凋亡的另一種典型死亡方式

分子克隆實驗---第三章：測序結果解讀2025/04/01

一代測序是克隆實驗中常見的下游實驗。現代DNA測序技術源于Sanger鏈末端終止測序法，其工作原理與Sanger測序不同的是4組反應的雙脫氧核苷酸分別用不同的熒光分子標記，每個試管的產物在光激發下發出不同顏色的熒光，延伸反應和鏈終止完成后，將全部4組反應物混合，在同一泳道進行凝膠電泳，通過激光束激發熒光分析不同位置堿基的熒光顏色完成測序分析。一般情況下，測序信號文件多為*.ab1文件，該文件能夠得到每個堿基的測序峰型及整體質量；*.seq文件則為ab1文件導出得到的測序結果序列，ab1文件中已具

分子克隆實驗的流程及注意事項--四、定點突變2025/03/24

四、定點突變定點突變引物設計與PCR擴增1.引物設計要求：5’-15-21bp反向互補區域+至少15bp非互補區域-3’，反向互補區域GC含量40%-60%，待突變位點至引物3’端Tm值60°C。根據實驗需求選擇對應模塊進行引物設計；2.建議使用試劑盒搭配的擴增模塊進行PCR擴增，并摸索退火溫度，優化反應體系和程序；3.PCR擴增體系的模板質粒投入量推薦50μl體系投入1ng，擴增循環數應當≤35個。擴增產物DpnI消化和純化回收1.取5μl擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，判斷是否存在目的大小的

分子克隆實驗的流程及注意事項--三、同源重組2025/03/24

本方法適用于總長度（載體+所有片段）不超過20kb的重組實驗。目的片段引物設計與PCR擴增1.2.1.引物同源臂設計要求：15-20bp(不計算酶切位點)，GC含量40%-60%；根據實驗需求選擇對應模塊進行引物設計；2.建議使用高保真酶進行目的片段的PCR擴增，并摸索退火溫度，優化反應體系和程序。載體線性化1.雙酶切：同時選擇兩種限制性內切酶對載體質粒進行線性化處理。內切酶選擇可參考第二章第一節內容；2.單酶切：選擇一種限制性內切酶對載體質粒進行線性化處理。內切酶選擇可參考第二章第一節內容；3

分子克隆實驗的流程及注意事項--二、TOPO克隆2025/03/19

二、TOPO克隆引物設計與PCR擴增1.目的片段PCR擴增引物合成時，要求引物5’端不可磷酸化修飾；2.建議使用高保真酶進行目的片段的PCR擴增，并摸索退火溫度，優化反應體系和程序。PCR產物的純化回收1.PCR反應后，產物應當進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，判斷是否存在目的大小的條帶；2.推薦使用切膠回收的方式純化(切膠時間最好控制在3min內，避免紫外照射對DNA的損傷)，回收濃度使用NanoDrop/OneDrop等儀器檢測，濃度應當≥30ng/μl，并跑膠鑒定是否僅存在目的條帶；3.回收濃度低時

分子克隆實驗的流程及注意事項--一、酶切連接2025/03/18

一、酶切連接一般來說，限制性內切酶的選擇非常重要。建議從以下方面判斷選擇：1.限制性內切酶的識別序列在目的載體中存在且只有一個，在目的片段中不存在；2.盡量選擇酶切產物為粘性末端、酶切效率高的限制性內切酶，如BamHI、HindIII等；3.雙酶切時，注意緩沖液對兩種內切酶的活性影響，可根據具體活性相應調整酶量和反應時間；若緩沖液不能同時滿足兩種酶的要求，需要分步酶切；4.單酶切時，建議對線性化載體進行去磷酸化操作，減少載體自身環化的出現。注：酶切后，為防止載體自連，尤其當酶切后產物末端可互補或

分子克隆實驗解決方案-第一章：分子克隆實驗概述2025/03/14

第一章：分子克隆實驗概述分子克隆技術是目前實驗室常用的實驗技術之一，研究者運用該技術能夠將DNA片段以體外重組的方式構建至載體，研究者運用該技術能夠將DNA片段以體外重組的方式構建至載體，隨后通過轉化操作導入合適的宿主中復制擴增，最后篩選得到滿足實驗需求的載體克隆。一、分子克隆實驗方法分子克隆研究一般需要將特定DNA片段插入至載體形成重組質粒。根據不同的實驗目的，將常見的分子克隆技術進行分類：·入門克隆：TA克隆、TOPO克隆。·定向克隆：同源重組、酶切連接（黏性末端雙酶切反應）。·定點突變：堿

實時熒光定量 PCR 的結果分析--實時熒光定量 PCR 常用名詞2025/03/10

校正染料(ROX)校正加樣誤差或孔與孔之間的誤差，提供一個穩定的基線，極大地改進定量的精確度，提高重復管之間的數據重現性。注意：不同的儀器對ROX的需求不同。基線PCR的最初幾個循環，在此基線上熒光信號幾乎沒有變化。閾值可以相信的最小熒光值。CT值擴增曲線與閾值交點的橫坐標。二、結果有效性判斷融解曲線單峰(染料法)擴增曲線指數擴增區域，復孔間CT值STD閾值設置合理閾值位于指數增長期：儀器會自動計算閾值，但并非所有情況下儀器計算結果都是合理的，必要時進行手動調整。NTC確認無氣溶膠污染或可以忽略

實時熒光定量PCR應用及結果分析--相對定量和絕對定量2025/03/07

第三章：實時熒光定量PCR的應用一、相對定量測定不同樣品中基因表達量的相對值。內參基因的選擇(1)始終選擇表達充沛、均一的基因做為內參基因；(2)不要盲目選擇常用的內參基因；(3)常用內參基因：GAPDH，Actin，Tublin。內參基因的選擇至關重要，決定結果的有效性加入內參基因后：結果計算二、絕對定量根據標準品，測定樣品中基因表達量的絕對值(拷貝數)。標準品：具有明確拷貝數濃度的樣品A/克隆質粒B/PCR產物C/cDNA(擴增效率測定等用途可以使用，絕對定量不能使用)拷貝數計算平均分子量（

實時熒光定量 PCR 操作流程及注意事項---FAQ2025/03/04

FAQ總RNA提取-酚氯仿抽提法RNA降解組織樣本保存不當。RNA提取時需選擇新鮮組織或細胞樣本，若為凍存樣本，盡量避免反復凍融。樣品離開活體或原來的生長環境后，樣品中的內源RNase開始降解RNA，降解速度與內源RNase的含量及溫度有關。也可將新鮮組織充分浸泡在RNAKeeperTissueStabilizer(Vazyme#R501)中，組織可于室溫存放一周，4℃存放一個月或-20℃/-80℃長期保存。投入樣本較多，導致裂解不充分。RNA保存時間過久，發生降解。對提取的RNA進行純度和完整

實時熒光定量 PCR 操作流程及注意事項---實時熒光定量 PCR2025/03/04

實時熒光定量PCR操作流程概要基于SYBR染料法的qPCR反應體系以Vazyme產品ChamQTMUniversalSYBR®qPCRMasterMix(Vazyme#Q711)為例組分自備材料ddH2O、1.5ml離心管、qPCR管冰或移動冰盒操作流程（以ABIStepOnePlusTM為測試機型）基于Taqman探針法的qPCR反應體系以Vazyme產品AceQ®UniversalU+ProbeMasterMixV2(Vazyme#Q513)為例組分自備材料ddH2O、1.5ml離心管、qP

實時熒光定量 PCR 操作流程及注意事項--逆轉錄反應2025/02/27

操作流程概要基于后期為qPCR的逆轉錄反應體系以Vazyme產品HiScript®IIIRTSuperMixforqPCR(+gDNAwiper)(Vazyme#R323)為例自備材料RNase-free1.5ml離心管、0.2mlPCR管冰或移動冰盒組分操作流程2.配制逆轉錄反應體系3.進行逆轉錄反應相關產品安培生物致力成為推動生命科學進步值得信賴的合作者深圳/湛江安培生物科技有限公司,是一家具有核心的技術實力、先進的經營管理水平和完善的市場銷售體系的生物高科技企業。總部設在廣東，服務面向全國

實時熒光定量 PCR 操作流程及注意事項--RNA模板的制備2025/02/26

一、RNA模板的制備常見的RNA提取的方法：傳統的酚CHCl?抽提法和柱式抽提法。操作流程概要酚CHCl?抽提法以Vazyme產品RNAisolaterTotalRNAExtractionReagent(Vazyme#R401)為例自備材料CHCl?，異丙醇，75%乙醇(DEPC水配制)，DEPC水組分樣本制備（過多的樣本量可能會導致樣本裂解不充分，并使產物純度降低；）1mlRNAisolater能夠充分裂解的最大樣本量如下：貼壁細胞（對于貼壁牢固的細胞可用細胞刮勺剝離細胞）1.棄培養液，PBS

實時熒光定量PCR總述2025/02/10

第一章：實時熒光定量PCR總述一、實時熒光定量PCR的概念實時熒光定量PCR即Real-timePCR，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程，最后通過CT值和標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。二、實時熒光定量PCR的原理A化學原理變產物DNA分子為熒光信號，通過測定熒光值即可反映產物DNA分子量。B數學原理通過循環數“n”(CT值)來計算起始DNA量。三、實時熒光定量PCR方法的選擇四、實時熒光定量PCR的優勢比較不同樣品間某基因的“量”的方法：實時熒光定量PCR的優點：(1)能夠實時監測

提取純化產品冊---09 樣本快速裂解（P073）2025/02/08

RoomTempTMSampleLysisKit(P073)室溫裂解試劑盒(P073)--保存條件:2~8℃保存●操作簡捷室溫3min即可，無需復雜模板提取●裂解效率高裂解試劑與傳統試劑盒提取基因組效果一致。●應用廣泛兼容Taqman®探針法的SNP檢測，qPCR探針法定量，PCR擴增等；樣本兼容廣：可裂解新鮮血液、凍存血液、常規抗凝劑血液、組織勻漿、口腔拭子、FTA卡等多種樣本產品概述RoomTempTMSampleLysisKit是一個簡單快速的血液室溫裂解試劑盒。本試劑盒包含LysisBu

提取純化產品冊---08 外泌體（R603）2025/02/08

VEX®ExosomeIsolationReagent(fromplasma)血漿外泌體提取試劑(R603)●操作簡單快捷無需超高速離心機，一步沉淀●兼容低量樣本起始樣本血漿量可低至500μl●產量穩定可靠較低的離心力沉淀，獲得的外泌體結構更完整，較傳統提取方法具有更高產量保存條件:VEXExosomeIsolationReagent(fromplasma)保存于2℃-8℃ProteinaseK保存于-15℃~-30℃產品概述本產品是專門用于分離血漿樣本中外泌體的試劑，只需通過簡單的較低速度離心