前言

抗體-小分子藥物偶聯物（antibody drug conjugates, ADCs）, 是治療性生物制品的一類，可通過抗體精準識別靶向細胞，通過內吞作用進入靶向細胞后釋放出偶聯的小分子藥物，從而實現對靶向細胞精準殺滅的目的，并減少對于正常細胞的殺傷。由于ADC的設計原理，自2000年第一個ADC 藥物Mylotarg® (gemtuzumab ozogamicin) 被 FDA 批準后[1], 截止2025年6月，已經有19個ADC被批準上市。自2023年全球ADC銷售總額第一次突破百億美元后，2024年全球ADC銷售總額繼續超過百億美元，持續了強勁的增長勢頭。 

該藥物于2013年被FDA批準上市，用于HER2陽性乳腺癌的治療，2024年全球銷售額約為23億美元[2]。恩美曲妥珠單抗是一種靶向 HER2 的ADC，含有人源化抗-HER2 IgG1 曲妥珠單抗，該抗體通過穩定的硫醚連接體 MCC（4-[N-馬來酰亞胺甲基]環己烷-1-羧酸酯）與微管抑制藥物 DM1（美坦辛衍生物）共價結合，分子量分布范圍在147~158kDa, 其藥物/單抗偶聯比（drug to antibody ratio, DAR）分布為0~8，平均DAR約為3.5 [3]。由于其結構的復雜性，對其進行表征就顯得頗具挑戰性。在本文的研究中，我們使用今年美國質譜年會（ASMS）上剛剛發布的新一代二合一超高分辨質譜儀Excedion Pro Biopharma 對KADCYLA進行了全面的表征，證明了該平臺在生物制藥領域中出色的分析能力，尤其是電子轉移解離輔助高能碰撞碎裂（electron-transfer/higher-energy collision dissociation， EThcD）功能，有助于精準鑒定藥物偶聯位點，以及翻譯后修飾（Post-translational modification, PTM）的鑒定。

應用亮點

如前文所述，今年新發布的新一代二合一超高分辨質譜儀Excedion Pro Biopharma被用于KADCYLA的深入表征。該儀器的亮點包括但不僅限于拓展至m/z=12,000 Da的質量檢測范圍 （需配置BioPharma option），能夠滿足在非變性條件下對單克隆抗體單體/二聚體/三聚體，以及其他大分子量蛋白復合物進行分子量測定；選配的ETD功能，可以實現快速靈敏的ETD/EThcD碎裂，與高能碰撞碎裂（Higher-energy Collisional Dissociation, HCD）聯合使用，能夠獲得全面豐富的蛋白序列覆蓋度以及PTM鑒定信息。Excedion Pro Biopharma儀器結構如圖1所示，圖2展示了本次實驗中KADCYLA深入表征的流程。 

圖1. Excedion Pro BioPharma結構圖，相較于前代產品的硬件更新部分在圖上以藍色高亮標明。選配BioPharma Edition可以將質量檢測范圍拓展至m/z=12,000 Da (綠色方框部分)，選配ETD可以實現ETD/EThcD碎裂（紅色方框部分）。（點擊查看大圖）

圖2. KADCYLA表征流程圖。

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非變性條件下KADCYLA完整分子量測定

完整分子量測定是生物醫藥類產品表征中的一項，對于ADC而言，除完整分子量外，平均DAR值和藥物負載分布 （drug load distribution, DLD）也是評判藥物質量的關鍵屬性。在本實驗中，我們在非變性條件下對KADCYLA進行完整分子量測定。非變性條件使用中性緩沖鹽體系，與變性條件相比，蛋白分子更接近其天然狀態，且非變性條件下蛋白帶電更少，相鄰電荷態之間的質譜峰重疊更少，能夠減少質譜信號之間的互相干擾，有助于得到更準確的完整分子量測定結果。圖3展示了KADCYLA非變性條件下完整分子量測定的結果。為了使樣品更接近天然狀態，我們并未對其進行脫糖處理。由圖3A可見，在原始譜圖層面，偶聯了不同數目藥物和不同糖型組分的質譜峰基本實現基線分離，經解卷積后可清晰的觀察到0~8的藥物偶聯分布（圖3B），BioPharma Finder軟件可自動計算平均DAR值，該ADC的平均DAR值為3.47 （圖3C），與文獻報道的3.5一致。

（A）

（B）

（C）

圖3. 非變性條件下KADCYLA完整分子量測定結果。 A, 原始譜圖及局部放大圖。B, 解卷積譜圖。C，BioPharma Finder軟件能夠自動選取相關組分并計算平均DAR值。（點擊查看大圖）

數據依賴性的EThcD二級碎裂用于肽圖分析，

實現偶聯位點定位以及PTM鑒定

基于液質聯用的肽圖分析是生物治療型產品表征中的常用分析方法之一，可實現序列覆蓋度、各種化學修飾位點定位以及常見翻譯后修飾的定性定量分析等。在各種質譜碎裂技術中，由于HCD碎裂能夠將肽鍵打斷后產生豐富的b/y碎片離子用于肽段鑒定，故其被廣泛應用于肽圖分析中。然而，對于一些修飾肽段，例如糖肽、連接子-藥物偶聯肽段等，由于HCD會將糖鏈/連接子-藥物偶聯打碎，所以對于有多個潛在修飾位點的肽段，使用HCD碎裂無法精確定位修飾位點；另外，對于一些含有異構化氨基酸的肽段，例如亮氨酸/異亮氨酸、天冬氨酸/天冬氨酸異構化等，由于HCD產生的b/y離子質量相同，故無法對其進行區分。而ETD因為反應機理不同，既可以在碎裂肽段骨架的同時完整保留糖鏈、連接子-藥物偶聯等側鏈修飾，對于異構化氨基酸，也可以產生特征性的診斷離子，從而實現異構化氨基酸的鑒定和區分。在ETD碎裂的基礎上添加HCD輔助碎裂，即EThcD，可以在同一張二級譜圖中同時得到b/y及c/z離子，得到更加全面豐富的信息實現肽段，尤其是修飾/異構化肽段的表征。Excedion Pro 二合一超高分辨質譜儀配備ETD選項后，可實現快速、靈敏的ETD/ETchD碎裂，可以設置數據依賴性的EThcD二級碎裂（data dependent EThcD MS2, dd EThcD MS2）數據采集模式，與數據依賴性的HCD二級碎裂（dd HCD MS2）形成互補，以獲得肽圖分析信息。

在本文的研究中，我們分別使用Trypsin和AspN兩種蛋白酶對KADCYLA進行了變性酶解，隨后對于兩種不同蛋白酶酶解的樣品，均進行了dd HCD MS2 以及 dd EThcD MS2數據采集，以獲得序列覆蓋度、偶聯位點分布和翻譯后修飾等信息。使用dd HCD MS2，Trypsin和AspN酶解的樣品均可實現一針進樣100%序列覆蓋度（數據未展示）。圖4展示了使用dd EThcD MS2, Trypsin和AspN酶解的樣品肽圖分析的基峰譜圖（Base Peak Chromatogram, BPC）以及序列覆蓋圖，同樣可以達到一針進樣100%序列覆蓋度，證明了Excedion Pro 二合一超高分辨質譜儀的ETD/ETchD碎裂可與常規流速液相色譜兼容，獲得高質量的二級譜圖用于肽圖分析。 

圖4. KADCYLA肽圖分析基峰譜圖和序列覆蓋度，均為dd ETchD MS2數據采集模式。左，Trypsin酶解樣品。右，AspN酶解樣品。 對于不同蛋白酶酶解樣品，均可實現單針進樣100%序列覆蓋。（點擊查看大圖）

如前文所述，KADCYLA的連接子-藥物（MCC-DM1）是通過共價結合方式偶聯在賴氨酸上的，曲妥珠單抗的N末端也會發生偶聯，故對于整個KADCYLA分子而言，潛在的偶聯位點共有92個，其中不重復的位點有46個（圖5）。由于賴氨酸被共價偶聯后會產生空間位阻，導致trypsin漏切，所以trypsin酶解會產生包含多個賴氨酸的連接子-藥物偶聯肽段，而HCD碎裂會同時打碎肽段骨架和偶聯藥物，導致無法僅憑HCD二級譜圖準確判斷藥物偶聯位點。而EThcD由于碎裂機理不同，可以在碎裂肽段骨架的同時保留藥物偶聯基團，優化后的HCD輔助碎裂能量可以使肽段碎裂更充分，同時保留完整偶聯的藥物。表1展示了分別使用HCD和EThcD對Trypsin酶解樣品進行二級碎裂，獲得的藥物偶聯位點信息匯總，46個潛在修飾位點中，鑒定到了43個存在藥物修飾，可見使用EThcD碎裂，對于含有多個潛在偶聯位點的肽段，可以準確定位偶聯位置，與HCD結果結合，可以獲得全面詳實的偶聯位點信息。

圖5. KADCYLA分子全部潛在修飾位點，以紅色方框在蛋白序列中標出，總共92個位點，其中不重復的有46個位點。

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表1. KADCYLA鑒定位點匯總

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紅色字體，偶聯位點。“++”, 偶聯位點可通過二級碎片離子確認。 “+”, 該肽段上存在偶聯，但無法通過碎片離子確認具體偶聯位置。“-”, 未鑒定到偶聯。

使用AspN對KADCYLA進行酶解時，重鏈會產生一條含有三個賴氨酸的肽段DK(216)K(217)VEPK(221)SC，且通過trypsin酶解樣品的肽圖分析結果可知，這三個賴氨酸均有被偶聯的可能。KADCYLA的MCC-DM1連接子-藥物含有一個異構中心（圖6，左上），導致藥物偶聯肽段在反相色譜上均會以對峰的形式被洗脫。如圖6所示，由于多個潛在偶聯位點和MCC-DM1異構化中心的存在，肽段DK(216)K(217)VEPK(221)SC的提取離子流圖（Extract ion current, XIC）呈現多組對峰。得益于EThcD碎裂產生的信息豐富的二級譜圖，可以準確鑒定不同保留時間洗脫的肽段是哪一個位點發生了偶聯（圖6，下），并且可以根據XIC峰面積計算每種修飾的相對比例（圖6，右上）。

圖6. 通過EThcD對含有多個偶聯位點的肽段進行偶聯位點鑒定。（點擊查看大圖）

對于ADC樣品，除藥物偶聯位點外，與藥品質量相關的各種翻譯后修飾也需要表征和監控。圖7展示了基于EThcD二級碎裂譜圖，對肽段FNWYVisoD(283)GVEVHNAK的天冬氨酸異構化的鑒定結果。得益于儀器平臺的高靈敏度和高質量精度，即使相對含量只有未修飾肽段0.18%的異構化肽段，仍然可以鑒定到豐富的c/z離子，還有天冬氨酸異構化在ETD碎裂中產生的特征性c+57/z-57離子，從而實現天冬氨酸異構化的確證。對于其他常見的翻譯后修飾，如脫酰胺、氧化和糖基化等，均可得到相對定量結果（圖8）。

圖7. 使用EThcD碎裂確認天冬氨酸異構化。下方局部放大圖可觀察到c+57/z-57離子。（點擊查看大圖）

圖8. 其他常見翻譯后修飾相對定量結果，所有結果均為三針dd ETchD MS2重復進樣平均值。A, 甲硫氨酸氧化。B, 天冬酰胺脫酰胺。C, 天冬酰胺琥珀酰亞胺化。D, 色氨酸氧化。E, 重鏈N-糖基化。（點擊查看大圖）