服務簡介

酵母是一種單細胞低等真核生物，培養條件普通，生長繁殖速度迅速，能夠耐受較高的流體靜壓，用于表達基因工程產品時，酵母具有與其他真核生物類似的蛋白質分泌途徑，外源基因的分泌表達，不僅方便了表達產物的分離純化，同時也和表達產物的翻譯后加工有關。酵母表達系統由于兼具原核以及真核表達系統的優點，因此利用此系統可高水平表達蛋白。常用的表達系統有釀酒酵母表達系統和甲醇酵母表達系統，而甲醇酵母表達系統較為常見，以畢赤酵母屬(Pichia)應用較多。

釀酒酵母(Saecharomycescerevisiae)被認為是安全性生物，不產生毒素，但釀酒酵母難于高密度培養，分泌效率低，幾乎不分泌分子量大于30 kD的外源蛋白質，也不能使所表達的外源蛋白質正確糖基化，而且表達蛋白質的C端往往被截短。因此，一般不用釀酒酵母做重組蛋白質表達的宿主菌。甲醇酵母表達系統是應用較多，甲醇酵母主要有漢森酵母屬(Hansenula)，畢赤酵母屬(Pichia)，球擬酵母屬(Torulopsis)等，并以畢赤酵母屬(Pichia)應用為主。利用甲醇酵母表達外源性蛋白質其產量往往可達克級，與釀酒酵母相比其翻譯后的加工更接近哺乳動物細胞，不會發生超糖基化。

酵母表達系統是研究真核蛋白質表達和分析的有力工具，一是含有*的強有力的AOX (醇氧化酶基因)啟動子,用甲醇可嚴格地調控外源基因的表達。二是培養成本低，產物易分離，畢赤酵母所用發酵培養基成本合理，一般碳源為甘油或葡萄糖及甲醇，期為無機鹽，培養基中不含蛋白，有利于下游產品分離純化。三是外源蛋白基因遺傳穩定，外源基因能以高拷貝數整合到畢赤酵母基因組中，不易丟失并能得到高表達菌株。四是作為真核表達系統，畢赤酵母具有真核生物的亞細胞結構，具有糖基化、脂肪酰化、蛋白磷酸化等翻譯后修飾加工功能。

服務內容

百歐泰生物的酵母分泌表達系統采用的宿主是巴氏畢赤酵母(Pichia pastoris)，該表達系統是近年來發展迅速、應用較多的一種真核表達系統。百歐泰生物酵母分泌表達系統服務項目包括：

①重組酵母表達質粒構建；

②重組質粒電轉化；

③重組表達子篩選；

④小規模蛋白表達和純化（24培養基培養產物）。

實驗原理

以巴斯德畢赤酵母表達外源基因為例，畢赤酵母中含有兩個乙醇氧化酶（Alcohol oxidase, AOX）分別編碼基因AOX1和AOX2，兩種序列相似。AOX1基因嚴格受甲醇誘導和調控。當甲醇為碳源時，AOX1啟動子可被甲醇誘導，啟動乙醇氧化酶的表達，從而用甲醇進行代謝。甲醇酵母的表達載體為整合型質粒，載體中含有與酵母染色體中同源的序列，很容易整合到酵母基因組中，大部分甲醇酵母的表達載體（質粒）中都有甲醇酵母醇氧化酶基因（AOX1），在該基因啟動子(PAOX1)作用下，質粒可用來促進編碼外源蛋白的目的基因的表達。

實驗流程

?將目的基因克隆入畢赤酵母表達載體，收獲陽性重組表達質粒；

?用適當的限制性內切酶消化陽性重組質粒，使之線性化；

?將線性化的陽性重組質粒轉化人巴斯德畢赤酵母菌株（如GS1 15，KM71）；

?將轉化物接種HIS4缺陷平板進行初次篩選；

?用不同濃度的G418平板進行第二輪篩選；

?挑選10~20個克隆進行小規模誘導培養，鑒定外源基因的表達量；

?挑選高水平表達菌株進行大規模誘導培養以制備外源基因的表達蛋白質。

實驗服務流程

雙方溝通一致后確定實驗方案，確定服務要求-簽訂合同—預付款-開始實驗-成果交付

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