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免疫組化技術(shù)要點(diǎn)和常見(jiàn)問(wèn)題
點(diǎn)擊次數(shù)：3471 發(fā)布時(shí)間：2010-12-27
免疫組化技術(shù)要點(diǎn)和常見(jiàn)問(wèn)題
在免疫組化過(guò)程中，為了更好的說(shuō)明問(wèn)題和查找原因，設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照片（已知的高表達(dá)相應(yīng)抗原的組織）和陰性對(duì)照組織片（不加一抗但是加二抗系統(tǒng)/不加任何抗體兩組），所有操作過(guò)程應(yīng)*一致。
染色弱或者沒(méi)有染色（按照先后順序，先排除一些簡(jiǎn)單的原因）：
試劑使用順序錯(cuò)誤或者漏加試劑重復(fù)實(shí)驗(yàn)，保證每一步均正確
二抗和一抗不匹配選擇匹配的二抗
底物和酶不匹配選用匹配的底物
酶失活換用新的酶（將酶和底物混合，看是否顯色？）
組織中沒(méi)有待測(cè)抗原表達(dá)或者表達(dá)水平低使用陽(yáng)性對(duì)照片
抗體濃度太低增加抗體濃度.使用不同濃度的抗體，決定*濃度
抗體孵育時(shí)間不充分延長(zhǎng)抗體孵育時(shí)間
底物孵育不充分延長(zhǎng)底物孵育時(shí)間
抗體儲(chǔ)存不當(dāng)，導(dǎo)致失效將抗體分裝，低溫保存 （-20 to -70 C） ，避免反復(fù)凍溶。稀釋抗體在4保存1-2周，避免時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。或者根據(jù)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行恰當(dāng)?shù)谋４?br />一抗失效換用新的一抗
二抗失效換用新的抗體（能否成功與其它一抗配合？）
脫石臘不充分延長(zhǎng)脫臘時(shí)間或者換用新的二甲苯
組織固定不充分或者不當(dāng)增加固定時(shí)間或者改用不同的固定方法
組織固定過(guò)度減少固定時(shí)間。若已固定過(guò)度，則需使用正確的或者推薦的抗原修復(fù)方法
復(fù)染試劑與底物系統(tǒng)不匹配選擇正確的復(fù)染試劑（不加復(fù)染劑，看是否有組織染色？）
封片劑不正確選擇正確的封片劑
可能原因解決辦法
洗片不充分每步之間至少洗片3次
組織含有內(nèi)源性的酶，如HRP/AP在加入一抗之前使用3％的H2O2甲醇封閉內(nèi)源性HRP活性，使用左旋咪唑（levamisole）溶液阻斷內(nèi)源性AP活性。或者換用葡萄糖氧化酶系統(tǒng)
組織含有內(nèi)源性生物素（尤其是腎臟、肝和脾）在加入一抗之前，血清封閉之后使用avidin/biotin阻斷試劑。或者避免使用biotin-avidin系統(tǒng)或改用IF方法（直接將酶和底物加到組織片上，看是否顯色？）
一抗的非特異性結(jié)合或者抗體濃度過(guò)高增加一抗的稀釋度
二抗和組織非特異性結(jié)合使用與二抗來(lái)源相同的正常動(dòng)物血清（一般是10％）封閉，必要時(shí)可以將血清濃度加大
組織固定不充分，抗原擴(kuò)散Increase duration of postfixation
使用小鼠來(lái)源的二抗檢測(cè)小鼠組織在加一抗之前使用MouseOnMouse封閉試劑
干片染色過(guò)程中避免出現(xiàn)干片現(xiàn)象
可能原因 解決辦法
一抗或者二抗?jié)舛冗^(guò)高降低抗體濃度。或者使用不同的濃度，決定*染色濃度
孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)減少孵育時(shí)間
孵育溫度太高降低孵育溫度，在4℃過(guò)夜或者37℃0.5-1小時(shí)或者RT
底物孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)減少孵育時(shí)間
干片染色過(guò)程中避免出現(xiàn)干片現(xiàn)象