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使用C18反相柱有哪些細節(jié)要注意
以下是關于C18反相柱使用細節(jié)的詳細解析，涵蓋選型、操作、維護及常見問題處理，旨在優(yōu)化分離效果并延長柱子壽命：
一、使用前準備
1. 柱子篩選與活化
- 填料參數(shù)匹配：根據(jù)樣品性質(zhì)選擇合適填料，如硅膠基質(zhì)(ODS)適用于常規(guī)分離，但需避免強酸強堿(pH 2-7.5)；聚合物基質(zhì)耐堿但不耐高溫，適合堿性樣品。
- 粒徑與孔徑：小粒徑(如5μm)適合高效分離，大孔徑(如300Å)適用于大分子(如蛋白質(zhì))。
- 活化操作：使用或存放后，用有機溶劑(乙腈或甲醇)低流速沖洗10個柱體積(CV)，使C18鏈充分伸展，避免“水相塌陷”導致的保留能力下降。
2. 流動相平衡
- 更換流動相后，需用目標流動相沖洗10-20 CV至基線平穩(wěn)，確保柱子達到熱力學平衡。若從純有機相過渡到含水相，建議初始有機相比例≥5%，再逐步調(diào)整。
二、流動相選擇與優(yōu)化
1. 溶劑體系
- 經(jīng)典組合：水-甲醇或水-乙腈，乙腈洗脫能力更強，適合中等極性樣品；甲醇對極性化合物保留更佳。
- 避免純水相：純水會導致C18鏈蜷縮，降低柱效，需至少含5%有機溶劑。
- 緩沖鹽與pH：
- 調(diào)節(jié)pH可改善酸堿性化合物的分離(酸性樣品pH<7增加保留，堿性樣品pH≥7增強選擇性)；
- 優(yōu)先選用易揮發(fā)的銨鹽緩沖液，避免難溶鹽析出堵塞柱子。
2. 梯度洗脫設計
- 采用線性梯度或階梯梯度，避免劇烈濃度變化沖擊柱子。
- 梯度結束后需用高有機相沖洗柱子，防止雜質(zhì)殘留。
三、樣品處理與進樣
1. 前處理要求
- 過濾：樣品需經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，去除顆粒物。
- 溶劑兼容性：樣品溶解溶劑需與流動相兼容，避免沉淀(如極性樣品用甲醇/乙腈溶解，疏水樣品可用少量水稀釋)。
2. 進樣控制
- 體積限制：進樣量通常為10-100 μL，過載可能導致峰形展寬或分離度下降。
- 濃度適配：高濃度樣品需稀釋，防止柱超載或污染。
四、操作參數(shù)設置
1. 流速與柱壓
- 常規(guī)流速為1-2 mL/min(5μm粒徑柱)，高壓可能壓縮填料導致柱效下降。
- 若柱壓驟升，需檢查是否堵塞或污染，及時沖洗或反沖。
2. 柱溫控制
- 室內(nèi)即可滿足多數(shù)需求，但對熱敏感樣品可降溫(如4℃)，復雜分離可適當升溫(≤40℃)加速傳質(zhì)。
五、維護與保存
1. 日常維護
- 沖洗：每次使用后用純有機溶劑(乙腈或甲醇)沖洗10 CV以上，去除殘留樣品。
- 封端保護：硅膠基質(zhì)柱需避免長時間接觸水或強酸強堿，定期用乙腈保存。
2. 長期存儲
- 保存于純有機溶劑(如乙腈)中，密封避光，禁止吹干或暴露于空氣(防微生物滋生或填料脫水)。
3. 再生處理
- 若柱效下降，可用高濃度有機溶劑(如100%乙腈)沖洗10 CV以上，或按廠商建議進行化學再生。
六、常見問題與解決方案
1. 峰形異常
- 拖尾：流動相pH不當或硅羥基未封端，可添加三乙胺或調(diào)整pH。
- 前伸峰：酸性樣品在低pH下保留不足，需降低pH或增加有機相比例。
2. 分離度差
- 優(yōu)化梯度程序，檢查流動相比例或更換封端完善的柱子。
3. 柱壽命縮短
- 避免強酸強堿、純水相及未過濾樣品；定期維護防止污染積累。