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北京迪科馬科技有限公司(迪馬科技)

使用C18反相柱有哪些細節要注意

時間:2025-7-15 閱讀:312
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  以下是關于C18反相柱使用細節的詳細解析,涵蓋選型、操作、維護及常見問題處理,旨在優化分離效果并延長柱子壽命:
  一、使用前準備
  1. 柱子篩選與活化
  - 填料參數匹配:根據樣品性質選擇合適填料,如硅膠基質(ODS)適用于常規分離,但需避免強酸強堿(pH 2-7.5);聚合物基質耐堿但不耐高溫,適合堿性樣品。
  - 粒徑與孔徑:小粒徑(如5μm)適合高效分離,大孔徑(如300Å)適用于大分子(如蛋白質)。
  - 活化操作:使用或存放后,用有機溶劑(乙腈或甲醇)低流速沖洗10個柱體積(CV),使C18鏈充分伸展,避免“水相塌陷”導致的保留能力下降。
  2. 流動相平衡
  - 更換流動相后,需用目標流動相沖洗10-20 CV至基線平穩,確保柱子達到熱力學平衡。若從純有機相過渡到含水相,建議初始有機相比例≥5%,再逐步調整。
  二、流動相選擇與優化
  1. 溶劑體系
  - 經典組合:水-甲醇或水-乙腈,乙腈洗脫能力更強,適合中等極性樣品;甲醇對極性化合物保留更佳。
  - 避免純水相:純水會導致C18鏈蜷縮,降低柱效,需至少含5%有機溶劑。
  - 緩沖鹽與pH:
  - 調節pH可改善酸堿性化合物的分離(酸性樣品pH<7增加保留,堿性樣品pH≥7增強選擇性);
  - 優先選用易揮發的銨鹽緩沖液,避免難溶鹽析出堵塞柱子。
  2. 梯度洗脫設計
  - 采用線性梯度或階梯梯度,避免劇烈濃度變化沖擊柱子。
  - 梯度結束后需用高有機相沖洗柱子,防止雜質殘留。
  三、樣品處理與進樣
  1. 前處理要求
  - 過濾:樣品需經0.22 μm濾膜過濾,去除顆粒物。
  - 溶劑兼容性:樣品溶解溶劑需與流動相兼容,避免沉淀(如極性樣品用甲醇/乙腈溶解,疏水樣品可用少量水稀釋)。
  2. 進樣控制
  - 體積限制:進樣量通常為10-100 μL,過載可能導致峰形展寬或分離度下降。
  - 濃度適配:高濃度樣品需稀釋,防止柱超載或污染。
  四、操作參數設置
  1. 流速與柱壓
  - 常規流速為1-2 mL/min(5μm粒徑柱),高壓可能壓縮填料導致柱效下降。
  - 若柱壓驟升,需檢查是否堵塞或污染,及時沖洗或反沖。
  2. 柱溫控制
  - 室內即可滿足多數需求,但對熱敏感樣品可降溫(如4℃),復雜分離可適當升溫(≤40℃)加速傳質。
  五、維護與保存
  1. 日常維護
  - 沖洗:每次使用后用純有機溶劑(乙腈或甲醇)沖洗10 CV以上,去除殘留樣品。
  - 封端保護:硅膠基質柱需避免長時間接觸水或強酸強堿,定期用乙腈保存。
  2. 長期存儲
  - 保存于純有機溶劑(如乙腈)中,密封避光,禁止吹干或暴露于空氣(防微生物滋生或填料脫水)。
  3. 再生處理
  - 若柱效下降,可用高濃度有機溶劑(如100%乙腈)沖洗10 CV以上,或按廠商建議進行化學再生。
  六、常見問題與解決方案
  1. 峰形異常
  - 拖尾:流動相pH不當或硅羥基未封端,可添加三乙胺或調整pH。
  - 前伸峰:酸性樣品在低pH下保留不足,需降低pH或增加有機相比例。
  2. 分離度差
  - 優化梯度程序,檢查流動相比例或更換封端完善的柱子。
  3. 柱壽命縮短
  - 避免強酸強堿、純水相及未過濾樣品;定期維護防止污染積累。

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