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基因測序方法如何做選擇

閱讀:1146        發布時間:2022-3-15

選擇測序方法的標準選擇測序方法的標準很多,取決于研究人員及其項目的性質。正在研究的生物學問題是關鍵。Pacific Biosciences 副總裁 Jonas Korlach 說:研究的背景決定了使用哪種類型的測序,因為不同的測序方法具有不同的特征來推動選擇。"

常見的標準包括測序時間、通量、成本和準確度——所有這些往往會相互影響。準確性、成本和數據吞吐量之間的動態一直是測序技術選擇的驅動因素,在不犧牲準確的情況下,成本和通量的提高推動了 DNA 測序對廣泛的應用。"

測序成本主要包括購買儀器費用、試劑耗材費用、樣本數量、計劃外包測序及測序前的準備步驟。還有另一個值得考慮的因素是要測序的目標的大小,這會影響測序時間和成本。

測序過程中產生的讀取長度也可能會影響決策,因為其中一些些應用需要長的讀取長度。比如:NGS 產生MIN讀長(約 50-500 bp),其次是 Sanger 測序(約 500-1000 bp),然后是長讀長測序(約 5-30 kb)。

桑格測序

Sanger 測序是一項久經考驗的技術,對于少量樣本來說簡單快速,能夠解析單個堿基對。它在摻入放射性標記的核苷酸類似物后通過鏈終止起作用。然后通過瓊脂糖凝膠電泳分離得到的 基因片段以進行鑒定。Sanger 方法對包含重復和二級結構的復雜 DNA 區域很有幫助,并且通常被用作驗證 NGS 檢測到的遺傳變異的正交方法。

但是,與 NGS 相比,Sanger 測序的通量較低,因此可能不適合大型項目。Sanger 測序可以對較小的 DNA 區域、一小組基因以及通常少于 1000 個樣本進行準確的測序

事實上,對于較小范圍的項目,使用 Sanger 基因 測序方法進行靶向或聚焦測序的項目時間、成本和復雜性要低得多,通常使用的是細管電泳法,即:在毛細管電泳儀器上的毛細管內使用 Sanger 測序化學,有助于查明基因片段中的單個堿基。

測序

測序目標的會嚴重影響測序方法的選擇。Sanger 測序適合少量基因或短基因組片段。NGS 測序發則適合用于 大面積的基因組或基因組測序。 與使用 Sanger 測序相比,NGS 測序法具有高通量的特點可以使大型項目快速、容易、低成本地進行完成測序所以NGS 是全基因組測序、全外顯子組測序、分析大型基因組、檢測稀有變異以及發現和診斷的較為理想選擇。然而,對于靶向測序,NGS 可能比 Sanger 貴。同時,NGS 所使用的 NGS 測序儀儀器成本較高,而且NGS 工作流程比 Sanger 測序更復雜

長讀測序

   在長讀長測序中,基因片段在穿過納米孔時單測序(Oxford Nanopore Technologies),或者在單個小孔中復制。較長的重疊序列使組裝更容易,就像用更少的大塊拼圖拼圖,而不是 NGS 中更多的小塊。其他優點包括消除了擴增偏差,并且可以更容易地檢測到大插入/缺失、重復區域等特征。長讀長測序的錯誤率可能高于 NGS,但持續的技術改進正在縮小準確度的差距。


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