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自文庫甘油儲存料中制備噬菌體抗體
閱讀：1672 發(fā)布時間：2010-11-29[器材和試劑]
● 500ml無菌聚丙烯離心瓶
● 2L培養(yǎng)錐形瓶
● RC5離心機和GS3轉頭（Sorvall）
● 2×TY/amp/glu培養(yǎng)基
● TYE/amp/glu平板
● 含有25ug/ml卡那霉素和2％葡萄糖的TYE平板（TYE/kan/glu）
● 含100ug/ml氨芐青霉素和25ug/m1卡那霉素的2×TY培養(yǎng)基（2×TY/amp/kan）
● 輔助噬菌體（VCSMl3、R408或M13K 07 Stratagene、NEB或Amersham Biosciences）
● 20％聚乙二醇（PEG）6000，2．5mol/L NaCl溶液
● 磷酸鹽緩沖液（PBS），pH 7．4
● 文庫甘油儲存料
[方法]
1．取適當數(shù)量（參見上述討論）的甘油文庫儲存料接種到含有250m1 2×TY/amp/glu的 2L培養(yǎng)錐形瓶中。培養(yǎng)基的A600值應小于0．05。從每個培養(yǎng)瓶中取1ul鋪板確定起始接種物的細菌量。
2．在37℃下振蕩（300r/min）培養(yǎng)，直到As。。值為0．05（L 5～2．5h）
3．按照輔助噬菌體與細菌之比等于（10～20）：1的比例加入輔助噬菌體。孵育培養(yǎng)液，37℃30分鐘，需水浴中直立放置并不時攪拌；而后，37℃振蕩培養(yǎng)30分鐘。
4．從每瓶中取lul并用1ml 2×TY稀釋；取1ul及10ul分別在TYE/amp/glu和TYE/ kan/glu平板上鋪板，以確定輔助噬菌體感染有效性。每個平板上的克隆數(shù)應當大致相同， 同時卡那霉素抗性克隆數(shù)應大于氨芐青霉素抗性克隆數(shù)的10％。
5．將500ml瓶裝入GS3轉頭，以3000r/min離心細菌培養(yǎng)液。棄去上清。
6．將細菌沉淀重懸于2×TY/amp/kan中，并分裝到2L錐形瓶中；其中的培養(yǎng)液不應超過250ml。在25～30℃下振蕩（300r/min）培養(yǎng)過夜。
7．用GS3轉頭及500ml瓶以10000r/min 30分鐘離心菌液。將上清部分轉移至1個新的500ml瓶內。
8．將l/10～1/5體積的PEG溶液加入到上清中，冰上放置1小時。這會使噬菌體沉淀，此時上清中會呈現(xiàn)云霧狀。
9．用GS3轉頭及500m1瓶以4000r/min，4℃15分鐘離心沉淀噬菌體。棄去上清。再離心“干”沉淀30秒， 以甩掉zui后幾滴上清。去除液體。用1/10體積的PBS重懸沉淀。
10．以10000r/minl5分鐘離心沉淀細菌碎片，并將上清轉移至1個新瓶中。
11．重復步驟7-9以進一步純化噬菌體，但zui終重懸液的體積應當是起始培養(yǎng)液體積的1/50。這樣制備的噬菌體可以立即用于選擇，否則需按每份1013個噬菌體等量分裝，保存于-80℃。