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般注意事項(xiàng)：

• Trizol試劑含有苯酚，具有毒性和刺激性，注意操作。如皮膚接觸Trizol，請(qǐng)立即用大量去垢劑和水沖洗，如仍有不適，請(qǐng)聽取醫(yī)生意見。
• RNase污染的主要來源是操作過程中手和空氣中的浮沉，注意隨時(shí)勤換手套，樣品盡可能蓋嚴(yán)；盡量不要對(duì)著RNA樣品呼氣或說話。用0.01%的DEPC水浸泡過夜，然后滅菌，烘干。溶液需用DEPC水配制。加0.01%（體積比） diethyl- pyrocarbonate（DEPC）至重或MiliQ級(jí)水中，處理過夜，滅菌即成DEPC水。
• 細(xì)胞裂解必需充分且操作迅速。裂解不*會(huì)降低zui后得率，因?yàn)橐徊糠諶NA會(huì)殘留在未裂解的細(xì)胞中。細(xì)胞裂解之后要看不見顆粒狀物質(zhì)（結(jié)締組織和骨除外）。在清洗和裂解細(xì)胞時(shí)在低溫下操作，防止在操作過程中釋放的內(nèi)源RNase降解了RNA。
• 酵母和一些細(xì)菌由于細(xì)胞壁的特殊結(jié)構(gòu)，可以加入TRNzol試劑同時(shí)加入無RNase的玻璃珠并劇烈振蕩，使細(xì)胞裂解充分。
• TRNzol試劑也適合于樣品和組織裂解液的貯存，這尤其適合于同時(shí)處理樣品較多或操作較為費(fèi)時(shí)時(shí)。

一：低得率

A：樣品裂解或勻漿處理不*；勻漿不*時(shí)，基因組DNA分子仍然很大，溶液粘稠。變性的蛋白質(zhì)和基因組DNA一起形成絮狀凝集物容易包裹RNA，使之不能有效地釋放到溶液中。

B：沉淀不*：從小于≤2×105動(dòng)物細(xì)胞、≤2 mg動(dòng)物組織或RNA含量低的樣品中提取RNA時(shí)，勻漿體積太大，將造成RNA過分稀釋而不能有效地沉淀下來。當(dāng)從這樣的樣品中提取RNA時(shí)，應(yīng)按比例減少抽提溶液，異丙醇沉淀后延長冰浴和離心時(shí)間，具體實(shí)驗(yàn)參數(shù)見相應(yīng)操作步驟。加入少量糖原可提高RNA產(chǎn)量又不影響RT-PCR。

C：zui后得到的RNA沉淀未*溶解

二：A260/A280<1.65

A．檢測(cè)吸光度時(shí)，RNA樣品不是溶于TE，而是溶于水。低離子濃度和低pH條件下，A280值會(huì)較高。

B．樣品勻漿時(shí)加的試劑量太少。

C．勻漿后樣品未在室溫放置5分鐘。

D．水相中混有有機(jī)相。

E．zui后得到的RNA沉淀未*溶解。

三：RNA降解

A．組織取出后沒有馬上處理或冷凍；細(xì)胞生長過度

B．樣品或提取的RNA沉淀保存于-5－-20℃，未在-60－-70℃保存。

C．細(xì)胞在胰酶處理時(shí)被破壞或勻漿中組織或細(xì)胞成分未*分散，樣品中RNA酶未*滅活。。

D．溶液或離心管未經(jīng)RNase去除處理。Tip頭、離心管、貯存管受RNA酶污染。

E．電泳時(shí)使用的甲酰氨pH低于3.5

F．樣品存放時(shí)間太長，裂解液中b-ME不足；

四：DNA污染

A：操作不規(guī)范

B．樣品中含有組織溶劑（如乙醇，DMSO等），強(qiáng)緩沖液或堿性

溶液。

C．樣品勻漿時(shí)加的試劑體積太少或樣品量太多，污染有機(jī)物和中

間相。

D：在轉(zhuǎn)錄特別活躍的細(xì)胞破碎過程中，由于某種原因一部分mRNA與DNA、蛋白質(zhì)形成了聚合體的形式.Trizol不能分離這種聚合體，從而造成了在所提取的RNA中有少量基因組DNA的污染.在這種情況下可以用無RNAse的DNAse處理，Trizol再次抽提或蛋白酶K消化后再用酸性苯酚抽提。
 

五：蛋白和多糖污染

離心去上清后得到的RNA沉淀經(jīng)以下操作應(yīng)可去除這些污染：在上一步中，每使用1ml Trizol，在水相中加0.25ml異丙醇和0.25ml高鹽溶液（0.8M檸檬酸鈉和1.2 NaCl）。混合，離心，然后按照操作進(jìn)行。這種方法可使蛋白多糖和多糖留在溶液中，而沉淀出純RNA。從植物中提取RNA時(shí)，應(yīng)在勻漿后離心，并加上以上操作步驟。