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UV滅活載體噬菌體的制備
閱讀：1164 發布時間：2011-1-4[器材和試劑]
● XL1-B1ue或者DHF’TB細胞
● f1R1噬菌體
● TB
● TBS（tris緩沖鹽水；50mmol/LTris- HCL pH 7．6 ,150mmol/L NaCl，0．05％硫柳汞）
● PEG/NaCl溶液（20％PEG，2，5mol/L NaCl）
● 皮氏培養皿，直徑150mm（Falcon）
● UV Stratalinker 2400（Stratagene）
● 硫柳汞（Sigma）
[方法]
1．用來自備存材料的或直接取自一個噬菌斑的f1Rl噬菌體，其濃度大約為109個噬菌斑形成單位（pfu）， 感染2ml XLl-B1ue（Stratagene） 或者DH5。F’TB細胞。37℃靜止孵育15分鐘，再攪動2～3小時。
2．在一個2L燒瓶中，將感染混合物稀釋到含有20ug/ml四環素的800mlTB液中。37℃孵育12-14小時，劇烈搖動（至少150r/min）。
3．用1000m1塑料瓶離心細菌/噬菌體懸液，10℃下4700r/min 60分鐘。
4．加入PEG 8000（終濃度4％）和NaCl（終濃度0．5mol/L）沉淀噬菌體。*溶解后，冰上放置4小時或4℃放置過夜。
5．4700r/min離心60分鐘。小心除去上清。以原體積1/10的TBS溶解沉淀。
6．在上清中加入1/4體積的PEG/NaCl溶液，再次沉淀噬菌體，4℃冰上孵育2小時。
7．4℃10000r/min離心噬菌體30分鐘，再用10mlTBS重懸噬菌體沉淀。
8．以8000r/min再次離心噬菌體15分鐘，然后去除不溶性部分，以pfu為單位滴定噬菌體。
9．用TBS稀釋已純化的噬菌體至大約每毫升1013個。在269nm處讀取吸光值（A269）以測量每毫升顆粒數：顆粒數/m1＝A269×稀釋因子× 6×1016/6407。
10．將每種稀釋比例的噬菌體溶液在各培養皿（直徑150mm） 中滴加20～25ul。可用自動分液器（比如Eppendorf 4780）操作，以節省時間并避免吸嘴污染。
11．用Stratalinker在200.000uj下，進行2～3個照射循環。
12．收集已照射的噬菌體，加入0．05％硫柳汞，并按1m1體積分裝，4℃保存。
13．通過測量pfu檢查存活的噬菌體。噬菌體滴度應當低于每毫升103個。