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技術(shù)文章

擴(kuò)增來自淘洗的噬菌體群落

閱讀:1142          發(fā)布時間:2011-1-4
[器材和試劑]
● 噬菌體緩沖液
● XLl-Blue或者DH5。F,TB細(xì)胞
● IPTG(30mg/m1儲存液,水溶液;儲存在-20℃)
● LB-瓊脂培養(yǎng)基+Amp/X-gal/IPTG
● Luria-Bertani(LB) [L-液體培養(yǎng)基(1%細(xì)菌用胰蛋白胨,0,5%酵母提取物,0.085m01/LNaCl,pH 7.2)]
● LB+Amp(L-液體培養(yǎng)基,50ug/m1 Amp)
● X-gal(30mg/m1儲存液,溶于N,N-二甲基甲酰胺中;暗處儲存在一20℃)
● LB-瓊脂培養(yǎng)基+Amp/Glu[L-瓊脂培養(yǎng)基,50ug/ml Amp,1%葡萄糖]
● 甘油(Sigma)
● M13K07輔助噬菌體(Amersham BioSciences)
● 硫柳汞(Sigma)
 
[方法]
1.用從磁珠上洗脫下來的已中和噬菌體,感染大約5m1 TB細(xì)胞。37℃孵育10分鐘, 勿攪動。
2.快速離心以沉淀細(xì)菌細(xì)胞。去除上清,用1-2m1 LB重懸細(xì)胞。將細(xì)胞在直徑15mm的LB-瓊脂培養(yǎng)基+Amp/Glu平板上鋪板,37℃下孵育過夜,zui大密度為每板5×103個細(xì)胞。
3.次日,用接近10ml的LB牛10%甘油刮取細(xì)胞。小量分裝并儲存在-20℃。
4.在20mlLB+Amp中孵育細(xì)胞。調(diào)整細(xì)胞濃度到OD600≈0.05, 然后劇烈振搖(至少300r/min)培養(yǎng)至光密度OD600≈0.25。
5.在37℃下孵育細(xì)胞15分鐘,極溫和地攪動。
6.用輔助噬菌體M13K07超感染細(xì)菌培養(yǎng)物(感染復(fù)數(shù)moi=30)。加入IPTG(終濃度為0.1mm01/L),溫和攪動10分鐘,在37℃下劇烈振搖孵育5小時。
7.以5000r/min 4℃離心細(xì)菌/噬菌體懸液30分鐘, 回收上清。在LB-瓊脂培養(yǎng)基+Amp/X-gal/IPTG平板上,滴定噬菌體上清的TU(通常滴度在l×l010Tu/m1以上)。將噬茵體上清液小量分裝,再加入0.05%硫柳汞儲存。
8.加入PEG 8000和NaCl溶液(終濃度分別為4%和0,5mol/L)沉淀噬菌體顆粒,然后4℃冰上孵育2~4小時。
9.4℃5000r/min離心40分鐘回收噬菌體沉淀,再以原溶液體積的1/10 TBS重懸沉淀。
10,70℃水浴中孵育噬菌體懸液30分鐘,使污染的細(xì)菌蛋白變性; 以4℃10000r/min離心30分鐘去除之。
11.以TU為單位在LB-瓊脂培養(yǎng)基+Amp/X-gal/IPTG平板上滴定噬菌體懸液。次輪淘洗需用109- 1011個噬菌體。

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