三级片视频播放,精品三级片在线观看,A级性爱视频,欧美+日韩+国产+无码+小说,亲子伦XX XX熟女,秋霞最新午夜伦伦A片黑狐,韩国理伦片漂亮的保拇,一边吃奶一边做边爱完整版,欧美放荡性护士videos

多聚甲醛固定后的效應細胞或直接用效應細胞的胞膜（其膜表面有跨膜型TNF-a），按一定比例加入靶細胞，如L929，以觀察跨膜型TNF-a對靶細胞的細胞毒活性。

1．材料 ①L929細胞株；②1％多聚甲醛溶于RPMI-1640培養液中；③PBS，pH7．2；④0．5％MFIT。

2．多聚甲醛固定法
（1）以105／孔效應細胞置96孔培養板培養，可加用刺激物，如LPS（100ns／mL）刺激一定時間后，棄上清。
（2）PBS洗一次后，用1％多聚甲醛RPMI—1640室溫下固定15—20min，用PBS洗數次以去除多余甲醛。
（3）按效／靶細胞為10：1的比例加入靶細胞104／孔，分別設僅有靶細胞的對照組及僅有效應細胞的對照組，終末體積100uL，37C，培養48h。
（4）加入10uLMTF／孔，孵育4ho
（5）再加入100gL0．IMmol／LHCl／10％SDS，37℃過夜。
（6）于波長570nm或630nm下測OD值。

3．單核細胞膜提取法
（1）單核細胞置于平皿經刺激或不刺激培養后，用RPMI-1640洗三次。
（2）在平皿中加入0．5mL RPMI-1640，用橡皮刷將單核細胞刮下，懸浮于PBS（含lmmol／LEDTA及lmmol／LPMSF）中。
（3）破膜 將單核細胞放人“液氮細胞裂解器”，20min，350psi。
（4）2 500r／min離心10min，取上清。
（5）將上清置于43％蔗糖（溶于A溶液：10rmnol／L HEPES pH7．33mmol／LMgCl2），200 000Xg離心45rain，在蔗糖界面收集細胞膜。100mmol／L KCI
（6）用溶液A將細胞膜洗一次，175 000Xg離心60min，以去除殘留的蔗糖。
（7）將膜懸浮于RPMI-1640中，蛋白濃度為2—5mg／mL，—70~C凍存。用于生物活性檢測的濃度為10ug／孔，其余步驟同上。