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用于噬菌體cDNA文庫展示的載體
閱讀：1508 發布時間：2010-7-28互補DNA（cDNA）克隆基因的表達是基因分離與鑒定的一個極為有效的工具。用于篩選的核苷酸探針需要所感興趣基因的原始序列信息，而對于表達cDNA文庫的篩選只需要一個天然的配體或一個特異的抗體（單克隆或多克隆）作為探針。體外篩選入噬菌體或質粒展示的cDNA文庫要將翻譯產物黏附在膜上，這樣優于用標記探針來篩選，但這種轉移能使cDNA編碼的蛋白變性且危及到檢測的準確性。而酵母雙雜交系統*在體內操作，重組了一個轉錄激活因子并通過報告基因的表達來檢測蛋白與蛋白之間的相互作用。總的來說，這些系統難以承擔大容量文庫的篩選任務，于是促進了基于選擇而不是篩選的多個系統的發展。由于敏感性和選擇性，通過反復富集和特異性相互作用的選擇要比篩選的要求更小。然而，選擇已表達的克隆，在此基礎上進行cDNA克隆只需要每個cDNA（為了擴增）和它的基因產物（為了檢測）之間有物理鏈接。為cDNA克隆基因表達設計的*批選擇系統中有一個系統發展為用于分離表達特異細胞受體的哺乳動物轉化株。zui近以來，作為從大容量文庫（≥108克?。┲羞x擇特異的結合肽或蛋白的強大工具，噬菌體展示技術的到來為cDNA克隆基因表達提供了發展的機會。
1 絲狀噬菌體
因為全長cDNA包括在3’末端的翻譯終止子，原核表達時缺乏合適的核糖體結合位點（如果這些cDNA來源于真核細胞），確保cDNA在噬菌體表達的zui實際的方法是將5’末端與載體基因融合。傳統上，噬菌體展示是與衣殼蛋白pⅢ或pⅧ的N末端融合，并且普遍認為直接與任一個衣殼蛋白的C末端融合都與噬菌體裝配不相容。因此，圍繞這些限制條件設計了三個專門的載體：一個策略是把pⅢ與c-Jun的亮氨酸拉鏈融合，而翻譯的cDNA產物與c-Fos（pJufo）的亮氨酸拉鏈的C末端融合。噬菌體裝配時，拉鏈結合在噬菌體的末梢，因此殼體包裹的eDNA與它編碼的產物相連。第二個策略是直接相互獲取法（Direct Interaction Rescue），利用小衣殼蛋白pⅢ的功能模塊性：eDNA通過與pⅢ的感染性結構域的C末端融合來表達，而蛋白探針放在pⅢ的C末端部分，包埋在噬菌體的核心。只有那些能在探針和特異的eDNA編碼產物之間建立穩定相互作用的噬菌體才能恢復它們的感染性，同時用來在大腸桿菌中擴增。第三個策略（在本章將詳細描述）是圍繞pⅢ并基于一個結論，這個結論是小衣殼蛋白pⅥ的C末端表達在表面，因此一個富含甘氨酸的六肽基因Ⅵ（gⅥ）-cDNA的融合基因可以在噬菌體表面顯示。蛋白Ⅵ（pⅥ）通過在pⅢ和噬菌體核心之間提供鏈接來穩定噬菌體的結構。這三個系統在蛋白配體和（或）多克隆抗血清選擇文庫中的eDNA克隆相互作用上被證明是成功的。zui近一團體出人意料地報道了通過優化聯接序列（8～10個氨基酸）與pⅢ或pⅧ的C末端融合，多肽能在絲狀噬菌體表面被功能性地展示出來。理論上，這個驚人的功能融合應該在eDNA克隆基因表達上起著很重要的作用，但是理論上的證據仍然需要證明。
2 溶解性噬菌體（lytic bacteriophage）
在絲狀噬菌體系統中，衣殼蛋白先組合成噬菌體顆粒，然后定位在外周胞質上。然而這種途徑適應于有二硫鍵形成的蛋白（例如分泌蛋白或受體的細胞外結構域），但它與在還原環境下能正常折疊的eDNA編碼產物不相容。事實上，大多數噬菌體顆粒內部結構相似，如入噬菌體、T4噬菌體、T7噬菌體，它們都用來展示編碼細胞內部蛋白的cDNA。在入噬菌體中，已經報道了與衣殼蛋白DEl5]或尾部蛋白VD6]的C末端融合。衣殼蛋白D用來顯示和選擇cDNA片段，這些片段來源于丙型肝炎病毒基因組、人腦以及小鼠的胚胎。在T4噬菌體中，衣殼蛋白WAC和SOC的C末端作為蛋白的靶點，用于共價展示，而T7噬菌體展示系統依賴于衣殼蛋白10A的C末端的溶解性。近年來，在多個報道中都證明了以eDNA選擇為目的的系統具有可用性。利用這個具有前景的方法制備一個克隆試劑盒在商業上是可行的（Novagen）。