載體主要有病毒和非病毒兩大類,其中質粒DNA是一種新的非病毒轉基因載體。
一、一個合格質粒的組成要素
復制起始位點Oril 即控制復制起始的位點。原核生物DNA分子中只有一個復制起始點。而真核生物DNA分子有多個復制起始位點。
＃抗生素抗性基因 可以便于加以檢測，如Amp+l ,Kan+
＃多克隆位點MCS 克隆攜帶外源基因片段l
＃P/E 啟動子/增強子l
＃Termsl 終止信號
＃加poly（A）信號l 可以起到穩定mRNA作用
二、如何閱讀質粒圖譜
*步：首先看Ori的位置，了解質粒的類型（原核/真核/穿梭質粒）
第二步：再看篩選標記，如抗性，決定使用什么篩選標記。
（1）Ampr 水解β－內酰胺環，解除氨芐的毒性。
（2）tetr 可以阻止四環素進入細胞。
（3）camr 生成氯霉素羥乙酰基衍生物，使之失去毒性。
（4）neor（kanr） 氨基糖苷磷酸轉移酶使G418（長那霉素衍生物）失活
（5）hygr 使潮霉素β失活。
第三步：看多克隆位點（MCS）。它具有多個限制酶的單一切點。便于外源基因的插入。如果在這些位點外有外源基因的插入，會導致某種標志基因的失活，而便于篩選。決定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。
第四步：再看外源DNA插入片段大小。質粒一般只能容納小于10Kb的外源DN***段。一般來說，外源DN***段越長，越難插入，越不穩定，轉化效率越低。
第五步：是否含有表達系統元件，即啟動子－核糖體結合位點－克隆位點－轉錄終止信號。這是用來區別克隆載體與表達載體。克隆載體中加入一些與表達調控有關的元件即成為表達載體。選用那種載體，還是要以實驗目的為準繩。
啟動子－核糖體結合位點－克隆位點－轉錄終止信號
＃啟動子－促進DNA轉錄的DNA順序，這個DNA區域常在基因或操縱子編碼順序的上游，是DNA分子上可以與RNApol特異性結合并使之開始轉錄的部位，但啟動子本身不被轉錄。l
＃增強子/沉默子－為真核基因組（包括真核病毒基因組）中的一種具有增強鄰近基因轉錄過程的調控順序。其作用與增強子所在的位置或方向無關。即在所調控基因上游或下游均可發揮作用。/沉默子－負增強子，負調控序列。l
＃核糖體結合位點/起始密碼/SD序列（Rbs/AGU/SDs）：mRNA有核糖體的兩個結合位點，對于原核而言是AUG（起始密碼）和SD序列。l
＃轉錄終止順序（終止子）/翻譯終止密碼子：結構基因的zui后一個外顯子中有一個AATAAA的保守序列，此位點down－stream有一段GT或T富豐區，這2部分共同構成poly（A）加尾信號。結構基因的zui后一個外顯子中有一個AATAAA的保守序列，此位點down－stream有一段GT或T富豐區，這2部分共同構成poly（A）加尾信號。l回答有人之前提出的一個問題：為什么質粒圖譜上有的箭頭順時針有的箭頭逆時針，那其實是代表兩條DNA鏈，即質粒是環狀雙鏈DNA，它的啟動子等在其中一條鏈上，而它的抗性基因在另一條鏈上.
三、介紹一下關于載體的知識（雖然課本上都有寫）
1. 什么是載體
即要把一個有用的基因（目的基因——研究或應用基因）通過基因工程手段送到生物細胞（受體細胞），需要運載工具（交通工具）攜帶外源基因進入受體細胞，這種運載工具就叫做載體（vector）。
P.S.基因工程所用的vector實際上是DNA分子，是用來攜帶目的基因片段進入受體細胞的DNA
2. 載體的分類
＃按功能分成：
（1）克隆載體都有一個松弛的復制子，能帶動外源基因，在宿主細胞中復制擴增。它是用來克隆和擴增DN***段（基因）的載體。（所以有時實驗時擴增效率低下，要注意是不是使用的嚴謹行載體）
（2）表達載體具有克隆載體的基本元件（ori,Ampr,Mcs等）還具有轉錄/翻譯所必需的DNA順序的載體。
＃按進入受體細胞類型分：（1）原核載體 （2）真核載體（3）穿梭載體（sbuttle vector）指在兩種宿主生物體內復制的載體分子，因而可以運載目的基因（穿梭往返兩種生物之間）.
P.S. 穿梭質粒含原核和真核生物2個復制子，以確保兩類細胞中都能擴增。
3. 基因工程載體的3個特點：
（一）都能獨立自主的復制：載體DNA分子中有一段不影響它們擴增的非必需區域，如MCS，插在其中的外源DN***段，能被動的跟著載體一起復制/擴增，就像載體的正常成分一樣。
（二）都能便利的加以檢測：如載體的藥物抗性基因，多是抗生素抗性基因，將受體細胞放在含有該抗生素培養板上培養生長時，只有攜帶這些抗性基因的載體分子的受體細胞才能存活。
（三）都能容易進入宿主細胞中去，也易從宿主細胞中分離純化出來。
4. 載體的選擇和制備：選擇載體主要依據構建的目的，同時要考慮載體中應有合適的限制酶切位點。如果構建的目的是要表達一個特定的基因，則要選擇合適的表達載體。
載體選擇主要考慮下述3點：
【1】構建DNA重組體的目的，克隆擴增/表達表達，選擇合適的克隆載體/表達載體。
【2】.載體的類型：
--－（1）克隆載體的克隆能力－據克隆片段大小（大選大，小選小）。如<10kb選質粒。
--－（2）表達載體據受體細胞類型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳類細胞表達載體。
--－（3）對原核表達載體應該注意3點：
------①選擇合適的啟動子及相應的受體菌；
------②用于表達真核蛋白質時注意克服4個困難和閱讀框錯位；
------③表達天然蛋白質或融合蛋白作為相應載體的參考。
【3】載體MCS中的酶切位點數與組成方向因載體不同而異，適應目的基因與載體易于鏈接，不產生閱讀框架錯位。
選用質粒（zui常用）做載體的4點要求：
①選分子量小的質粒，即小載體（1－1.5kb）→不易損壞，在細菌里面拷貝數也多（也有大載體）；
②一般使用松弛型質粒在細菌里擴增不受約束，一般10個以上的拷貝，而嚴謹型質粒<10個。
③必需具備一個以上的酶切位點，有選擇的余地；
④必需有易檢測的標記，多是抗生素的抗性基因，不特指多位Ampr（試一試）。
無論選用哪種載體，首先都要獲得載體分子，然后采用適當的限制酶將載體DNA進行切割，獲得分子，以便于與目的基因片段進行連接。
質粒載體 質粒（plasmid）是細菌或細胞染色質以外的，能自主復制的，與細菌或細胞共生的遺傳成分。其特點如下： ①是染色質外的雙鏈共價閉合環形DNA（covalently closed circuar DNA,cccDNA），可自然形成超螺旋結構，不同質粒大小在2-300kb之間，＜15kb的小質粒比較容易分離純化，＞15kb的大質粒則不易提取。 ②能自主復制，是能獨立復制的復制子（autonomous replicon）。一般質粒DNA復制的質粒可隨宿主細胞分裂而傳給后代。按質粒復制的調控及其拷貝數可分兩類：嚴緊控制（stringent control）型質粒的復制常與宿主的繁殖偶聯，拷貝數較少，每個細胞中只有1個到十幾個拷貝；另一類是松弛控制（relaxed control）型質粒，其復制宿主不偶聯，每個細胞中有幾十到幾百個拷貝。每個質粒DNA上都有復制的起點，只有ori能被宿主細胞復制蛋白質識別的質粒才能在該種細胞中復制，不同質粒復制控制狀況主要與復制起點的序列結構相關。有的質粒的可以整合到宿主細胞染色質DNA中，隨宿主DNA復制，稱為附加體，例如細菌的性質粒就是一種附加體，它可以質粒形式存在，也能整合入細菌的DNA，又能從細菌染色質DNA上切下來。F因子攜帶基因編碼的蛋白質能使兩個細菌間形成纖毛狀細管連接的接合（conjugation），通過這細管遺傳物質可在兩個細菌間傳遞。 ③質粒對宿主生存并不是必需的。這點不同于線粒體，線粒體DNA也是環狀雙鏈分子，也有獨立復制的調控，但線粒體的功能是細胞生存所必需的。線粒體是細胞的一部分，質粒也往往有其表型，其表現不是宿主生存所必需的，但也不妨礙宿主的生存。某些質粒攜帶的基因功能有利于宿主細胞的特定條件下生存，例如，細菌中許多天然的質粒帶有抗藥性基因，如編碼合成能分解破壞四環素、氯霉素、氨芐表霉素等的酶基因，這種質粒稱為抗藥性質粒，又稱R質粒，帶有R質粒的細菌就能在相應的抗生素存在生存繁殖。所以質粒對宿主不是寄生的，而是共生的。
