測定植物體內游離氨基酸含量對研究植物在不同條件下及不同生長發育時期氮代謝變化、植物對氮素的吸收、運輸、同化及營養狀況等有重要意義。

【原理】

游離氨基酸的氨基可與水合茚三酮反應，產生藍紫色化合物，其顏色的深淺與游離氨基酸的含量成正比。

【儀器設備】

分光光度計；電子天平；容量瓶25ml或50ml 3個；漏斗（直徑6厘米）3個、濾紙適量；20ml刻度試管 7支；移液管0.5ml 3支、5ml 1支；試管架；玻棒；吸耳球；剪刀；移液管架；橡皮筋、塑料薄膜（封試管口）；吸水紙；擦鏡紙適量；電爐；水浴鍋（含鐵絲筐）。

【試劑】

    1．3%茚三酮試劑  稱3g茚三酮用95%乙醇溶解定容到100ml容量瓶里，貯于棕色瓶中。此試劑應放在冷涼處，不宜久放，使用期約10天。

2．氰酸鹽緩沖液（按以下方法配制）：

（1）NaCN貯備液0.01mol/L（490mg/L）。

（2）醋酸緩沖液：稱360g醋酸鈉（含三分子結晶水）溶于約300ml無氨蒸餾水中，加66.67ml冰醋酸再用無氨蒸餾水稀釋至1L。

取溶液（1）20ml，用溶液（2）定容到1L。

3．標準氨基酸  稱取在80℃下烘干的亮氨酸13.1mg（或α-丙氨酸8.9mg）溶于10%的異丙醇中，并在100ml容量瓶中用10%異丙醇稀釋至刻度，混勻，即為1mmol/L的標準氨基酸貯備液，置冰箱中保存。為了制備工作液，可取貯備液與等量無氨蒸餾水混合，此液濃度為0.5mmol/L，即1ml含氨基酸0.5μmol，或氨基氮7μg。

4．95%乙醇；5．異丙醇（分析純）。

【操作步驟】

    1．標準曲線的制作  取20ml刻度試管18支，按下表15-1加入各試劑。加完試劑后混勻，在100℃水浴中加熱12min（加熱時封口），取出在冷水中迅速冷卻，立即于每管中加入5ml 95%乙醇，塞好塞子，猛搖試管，使加熱時形成的紅色產物被空氣中的氧所氧化而褪色，此時溶液呈藍紫色。于570nm波長下測其光密度（以空白管為參比），以氨基酸濃度為橫坐標，光密度為縱坐標，繪制標準曲線，求出直線方程。

表15-1  各試管加入試劑量

2．樣品提取  選取有代表性的植物葉片（或其它組織），洗凈擦干，剪碎混勻，迅速稱取0.10～0.20g（視氨基酸含量多少而定），共稱3份，分別加入20ml刻度試管中，再加蒸餾水10ml蓋塞（或系上塑料薄膜），置沸水浴中20min以提取游離氨基酸，到時取出在自來水中冷卻，把上清液濾入25ml容量瓶中，之后再往試管中加5ml蒸餾水，置沸水浴上再加熱10min，過濾并反復沖洗殘渣，zui后定容至刻度，搖勻。

3．樣品測定  另取4支潔凈干燥的試管，其中3支分別加入0.5ml提取液，另一支加0.5ml蒸餾水，然后在上述4支試管中分別加入NaCN緩沖液、水合茚三酮各0.5ml，加完試劑后蓋塞，置沸水浴上加熱12min，冷卻后，再分別加5ml 95%乙醇，搖勻，以空白作參比，在波長570nm下測其光密度。

根據光密度查標準曲線（或用回歸方程計算）即可求出提取液中氨基酸的濃度。

4．計算  游離氨基酸含量（NH₂ －Nμg / g FW）＝

式中  C－由直線方程計算的值，即0.5ml試樣中氨基酸的微摩爾數（_μmol）；

V－樣品提取液經稀釋后的總體積（ml）；

W－樣品重（g）。

測定結果按表15-2記錄。

表15-2 游離氨基酸總量測定記載表      測定日期：