PCR定量試劑盒前期的驗證引物探針性能和確定適反應條件是確保正式實驗順利進行的前提。那么前期驗證引物探針我們需要怎么確定呢？主要指標是基線、擴增曲線、Ct值、擴增效率、低濃度樣本檢出、CV等。
一、基線
基線是PCR擴增曲線中水平的線，在PCR擴增反應的循環(huán)中，熒光信號變化不大，成一條直線，這條直線即基線。
在PCR定量試劑盒引物探針篩選時，要注意基線是否水平。引物探針濃度純度都會影響基線，如導致基線上抬，下降等。而基線也是一個很直觀的指標。
二、擴增曲線
另一個直觀地指標是擴增曲線形態(tài)，呈S形曲線，避免有二次擴增，或者其他不正常的擴增曲線。
三、Ct值
從基線到指數(shù)增長的拐點對應的循環(huán)次數(shù)為Ct值。
對于同一個樣本，不同的引物探針結(jié)果為不同的擴增曲線，對應的Ct值受擴增效率，干擾程度等影響會不一樣，理論上我們選擇的引物探針Ct值越小越好。
評估PCR擴增效率可靠和穩(wěn)定的一種方法是標準曲線，也是被研究者們廣泛認可的。該方法涉及到制作一系列的樣品來控制目標模板的相對數(shù)量。PCR定量試劑盒通常由濃縮的原液連續(xù)稀釋而成，常用的是10倍稀釋。
使用一系列稀釋樣品，采用標準qPCR程序進行擴增獲得Cq值，然后根據(jù)各樣品濃度及相應的Cq值繪制標準曲線，得到線性方程Cq=-klgX0+b，擴增效率E=10(-1/k)-1。利用qPCR進行定量分析時，要求擴增效率范圍在90%-110%（3.6＞k＞3.1）。
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