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大腸桿菌電轉化感受態細胞制備及轉化方法
點擊次數：1439 發布時間：2013-1-8
*天：
1. 將適合菌株（如XL1-Blue, DH5α）置于LB或其他營養豐富的培養基上，在37°C下過夜培養
2. 高溫滅菌大的離心瓶（250-500ml）以備第二天搖瓶用
3. 準備幾瓶滅菌水（總量約1.5升），保存于冷凍室中以備第二天重懸浮細胞用
第二天：
4. 轉移0.2-1ml過夜培養物至裝有500ml LB（或其他營養豐富的培養基）的1-2升搖瓶
5. 37°C下劇烈振蕩培養2-6小時
6. 定時監控OD600值（培養1小時后每半小時測定一次）
7. 當OD600值達到0.5-1.0時，從搖床中取出搖瓶，置于冰上冷卻至少15分鐘（需要的話這種方式可以存放培養液數小時）
8. 細胞在4°C 5000g下離心15分鐘，棄上清液（如需要，沉淀可在4°C的10%甘油中保存一兩天）
9. 用滅菌的冰水重懸浮細胞。先用渦旋儀或吸液管重懸浮細胞于少量體積中（幾毫升），然后加水稀釋至離心管的2/3體積。
10. 照上面步驟重復離心，小心棄去上清液
11. 照上面步驟用滅菌的冰水重懸浮細胞
12. 離心，棄上清液
13. 用20ml滅菌的、冰冷后的10%甘油重懸浮細胞
14. 照上面步驟離心，小心棄去上清液（沉淀可能會很松散）
15. 用10%甘油重懸浮細胞至zui終體積為2-3ml
16. 將細胞按150μl等份裝入微量離心管，于-80°C保存
轉化方法：
1. 在冰上解凍電感受態細胞添加1-10μl DNA，冰上培育約5分鐘
2. 添加1-3μl DNA，冰上培育約5分鐘
3. 轉移DNA/細胞混合物至冷卻后的2mm電穿孔容器（無泡）中
4. 加載P1000，準備好300μl LB 或 2xYT
5. 對電穿孔容器進行脈沖（200 歐姆， 25μFd，2.5 千伏）（檢查時間常數，應該在3以上）
6. 立即添加300μl 的LB或2xYT至電穿孔容器中
7. 37°C下培養細胞40分鐘至1小時以復原
8. 轉移細胞至適當的選擇培養基上培養
詳情請看：大腸桿菌電轉化感受態細胞制備及轉化方法