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利用流式細胞術分析細胞周期時相
點擊次數：1518 發布時間：2013-1-11
詳情請看：利用流式細胞術分析細胞周期時相
一、實驗目的
掌握流式細胞儀的工作原理
掌握用流式細胞儀測量細胞群體DNA含量分布的方法
了解流式細胞術在細胞生物學研究中的應用
二、實驗原理
流式細胞儀的工作原理是將待測細胞放入樣品管中，在氣體的壓力下進入充滿鞘液的流動室。在鞘液的約束下細胞排成單列由流動室的噴嘴噴出，形成細胞柱。通過對流動液體中排列成單列的細胞進行逐個檢測，得到該細胞的光散射和熒光指標，分析出其體積、內部結構、DNA、RNA、蛋白質、抗原等物理及化學特征。
細胞內的DNA含量隨細胞周期進程發生周期性變化，如G0/G1期的DNA含量為2C，而G2期的DNA含量是4C。利用PI標記的方法，通過流式細胞儀對細胞內DNA的相對含量進行測定，可分析細胞周期各時相的百分比。
三、儀器、材料與試劑
儀器：流式細胞儀，細胞培養設備，離心機，水浴，冰箱
材料：HeLa細胞，5ml注射器，離心管，封口膜，微量移液器，Tips
試劑：70％乙醇（保存于4℃），RNase-A （10mg/ml,-20℃保存）
PI （650µg/ml，避光保存于-20℃），PBS（pH 7.4，保存于4℃）
四、實驗步驟
1、取對數生長期細胞，倒去培養液，胰酶適度消化細胞，用培養液吹打，800rpm , 離心 15 min去上清。
2、PBS洗2次，加0.5mL PBS吹勻，務必吹散。
3、用5mL注射器將細胞吸起，用力打入5mL 70%（預冷）乙醇中，封口膜封口。4℃固定過夜（可長至2周）
4、800rpm 15min收集固定細胞，PBS洗2次
5、用0.4mL PBS重懸細胞并轉至Tube中輕輕吹打（防止細胞破碎）
6、加RNase-A約3µL至終濃度約為50µg/mL ，37℃水浴消化30 min；
7、加PI約50µL至終濃度約為65µg/mL ，在冰浴中避光染色30 min。
8、用300目（孔徑40~50微米）尼龍網過濾，上機檢測。
9、樣品分析測定及打印。