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　如何利用ELISA篩選以及ELISA方法操作的注意事項有哪些呢？相信很多做實驗的小伙伴都有這樣的疑問，今天小編就給大家總結(jié)一下，注意聽講哦！

 

　　ELISA，全稱酶聯(lián)免疫吸附實驗，主要利用的是抗原抗體特異性結(jié)合的特點，可分為直接法、間接法、雙抗體夾心法、競爭法等。下面以間接法為例進行介紹：

 

　　1、方陣ELISA。用途：①融合前后確定鼠血清中抗體效價；②拿到單抗腹水后，需要建立ELISA方法時首先要確定包被原及抗體的優(yōu)質(zhì)工作濃度。

 

　　經(jīng)典的方陣ELISA：將抗原和抗體各自稀釋成不同梯度濃度，結(jié)果OD值P/N>2的均判為陽性，選取OD值在1.0左右的那個Ag-Ab濃度為工作濃度，其主要原因與酶標儀靈敏度有關(guān)。

 

　　但是，對于抗原抗體而言，由于它們被稀釋成不同濃度，那么在理論上，每個抗原稀釋度情況下，總有一個抗體的稀釋度其OD值在1.0左右，那么到底選取哪一個OD值1.0左右的好呢？這就需要同時用藥物做個抑制來看，哪個濃度下抑制情況好，就取哪個抗原抗體濃度做工作濃度。

 

　　2、間接競爭ELISA：在用方陣ELISA確定好抗原抗體醉佳結(jié)合濃度后就可以做間接競爭ELISA了，其目的主要是考察抗體的特異性、繪制標準曲線，計算抗體對抗原的半數(shù)抑制、檢測限等參數(shù)，也可以用來檢測未知樣品中的抗體。方法是用確定的抗原包被，在加一抗時同時加入不同濃度的標準品（一般是藥物），然后加二抗，顯色。用藥物（即標準品）濃度的對數(shù)為橫坐標、抑制率為縱坐標，繪制ELISA標準曲線，計算相關(guān)的參數(shù)，之后就可以將未知的樣品所測OD值代入曲線方程求其中抗體的含量。通常這是建立ELISA檢測方法的bi備項目。

 

　　標準曲線可以繪成直線或是曲線（二次方程或三次方程）。通常是選取線性比較好的幾個點繪成直線。直線斜率越高說明抗體的特異性及靈敏性好，R2

 

　　值越靠近1，則說明線性關(guān)系好。曲線繪好后，有一些常用的參數(shù)，如抑制率、半數(shù)抑制、檢測限、定量限、標準偏差、變異系數(shù)等等：

 

　　抑制率（%）＝1－B/B0（B0為不含藥物的OD值；B為含有藥物的OD值）

 

　　標準差（SD）＝[∑(Xi－B ) 2 / (n－1)] 1/2；

 

　　標準偏差（RSD）＝SD/B

 

　　半數(shù)抑制：指用藥物（半抗原）去做競爭實驗時呈現(xiàn)50%抑制效果時的藥物濃度。藥物濃度越低，而抑制率越高，則表示抗體對藥物的特異性越好，靈敏度也高。半數(shù)抑制濃度IC50對應(yīng)的OD值：OD IC50＝0.5?B0

 

　　檢測下限（LOD）對應(yīng)的OD值：ODLOD =B0－3SD；

 

　　定量限（LOQ）對應(yīng)的OD值：ODLOQ = B0－10SD；

 

　　3、間接ELISA操作中具體注意的問題：

 

　　間接ELISA一般有6個步驟：包被抗原、封閉、加一抗（在做競爭時同時加入藥物）、加二抗、顯色、終止。其中除了加顯色和終止外，其余步驟之間都要進行洗板。在這里面，每一步都非常重要，假如有一步疏忽都會造成結(jié)果的不準確。