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如何降低ELISA試劑盒背景因素的影響
閱讀：1471 發(fā)布時間：2015-9-22我司吳近日整理了一些相關ELISA試劑盒實驗技術，今天就說說降低ELISA試劑盒背景因素的影響建議 。科研人員來說ELISA實驗的原理和操作步驟并不陌生，不外乎固定抗原，添加一抗、二抗和底物，操作過程中夾雜著洗滌和封閉步驟。然而，即使是平淡無奇的洗滌和封閉，如果操作不合理，也會很大程度上影響實驗的準確度。實驗結束時我們是否能獲得有意義而且準確的信息，這在很大程度上取決于結果的信噪比，背景噪音會在很大程度上影響科研人員對結果的判斷。
關于如何在實驗過程中降低ELISA試劑盒背景因素的影響，下面介紹一些步驟要點。
洗滌很重要
洗滌步驟看似很簡單無聊，其實很重要，因為如果未結合的材料(如非特異結合的抗體或檢測試劑)殘留在微孔板中，就會增加背景噪音。如有必要，可增加洗滌液中的鹽濃度，這會阻止非特異結合反應。如果背景過高，懷疑洗滌不夠，可以嘗試增加洗滌次數。
封閉更關鍵
封閉液的作用是讓不相關的蛋白占據微孔板中潛在的結合位點。這就降低了可產生信號的抗體非特異結合的機會。實驗過程中達到抗體只與目的蛋白結合的目標。如果背景過高，懷疑封閉不充分，可以嘗試使用更高濃度的封閉液，或適當延長封閉時間。
如果您一直被背景問題所困擾，那就應該花些時間來優(yōu)化封閉液。這可能需要時間，但也是值得的。目前主要有兩種類型的封閉液：蛋白和非離子型去污劑。使用的類型須取決于多個因素，包括微孔板的表面試劑、吸附的抗原、您的抗體和檢測試劑。好的封閉液應降低非特異性結合，但它不應當與抗原、抗體或檢測試劑發(fā)生相互作用。
zui常用的非離子型去污劑是Tween-20。這種封閉液便宜、穩(wěn)定，在去除洗滌過程中的一些非特異結合上很有用。但它們只在存在時起作用，因為很容易被洗掉。因此所有洗滌液中也必須添加封閉液。請勿使用高濃度(正常濃度為0.01-0.1%)，它會降低特異結合，產生假陰性。另一個選擇是使用蛋白和非離子型去污劑這兩種封閉液，后者可協(xié)助洗滌過程中的封閉。
蛋白封閉液則有所不同，是*的。它們與開放位點結合并封閉，ELISA試劑盒同時穩(wěn)定與微孔板結合的抗原分子。常用的蛋白封閉液包括牛血清白蛋白(BSA)、脫脂奶粉、正常血清和魚明膠。血清組分的內在多樣性可使它有效攔截許多不同類型的分子相互作用。不過，它的缺點在于能與Protein A和IgG抗體相互作用。解決這個問題的一種方法是使用雞或魚的正常血清。
抗體濃度須優(yōu)化
通常我們會仿照“實驗前輩"留下來的操作步驟進行試驗，但是如果試劑稍有不同，則可能需要優(yōu)化抗體的量。記住，非特異的抗體結合會增加背景。為了防止這一點，切勿使用過多的一抗或二抗。
檢測試劑要適量
另一點也很顯而易見：切勿使用過多的檢測試劑。如果濃度過高，或者未正確稀釋，則會導致高背景。也不要顯色過度，如有必要，優(yōu)化一下何時應加入終止液。
如果ELISA遇到了高背景，那么也無需太擔心，依次查看ELISA系統(tǒng)中的組分，并排除可能存在的問題。悉心優(yōu)化，相信很快就會有有意義而且準確的實驗結果。