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恒遠(yuǎn)告訴大家：WB實驗的常見問題答疑（1）
閱讀：2443 發(fā)布時間：2012-7-25
恒遠(yuǎn)告訴大家：關(guān)于WB實驗的常見問題以及解決方案（1）
上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司是一家生物技術(shù)企業(yè)，主要從事免疫學(xué)、分子生物學(xué)和常規(guī)生化試劑的研發(fā)、銷售。并代理銷售Omega、Sigma、R&D、ATCC、HYCLONE等二十多家國外，致力于為廣大高校、科研院所和企事業(yè)單位提供*的科研試劑和完善的技術(shù)服務(wù)，滿足生物化學(xué)、分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)等生物科技實驗需求。
1、western blot 的優(yōu)點
答：靈敏，可達(dá)ng級，用Ecl顯色法理論上可達(dá)pg 級。方便，特異性高。
2、為什么我的細(xì)胞提取液中沒有目標(biāo)蛋白？
答：原因有很多: a） 你的細(xì)胞中不表達(dá)這種蛋白質(zhì)，換一種細(xì)胞；b） 你的細(xì)胞中的蛋白質(zhì)被降解掉了，你必需加入PMSF，抑制蛋白酶活性；c） 你的抗體不能識別目標(biāo)蛋白，多看看說明，看是否有問題。
3、我的細(xì)胞提取液有的有沉淀，有的很清亮，為什么呢？
答： a） 有沉淀可能因為你的蛋白沒有變性*，可以適當(dāng)提高SDS 濃度，同時將樣品煮沸時間延長， b） 也不排除你的抗原濃度過高，這時再加入適量上樣緩沖液即可。
4、我做的蛋白質(zhì)分子量很小（10KD），請問怎么做WB？
答：可以選擇0.2μml的膜，同時縮短轉(zhuǎn)移時間。也可以將兩張膜疊在一起，再轉(zhuǎn)移。其他按步驟即可。
5、我的目的帶很弱，怎么加強？
答：可以加大抗原上樣量。這是zui主要的。同時也可以將一抗稀釋比例降低。
6、膠片背景很臟，有什么解決方法？
答：減少抗原上樣量，降低一抗?jié)舛龋淖円豢狗跤龝r間，提高牛奶濃度。
7、目標(biāo)帶是空白，周圍有背景，是為什么？
答：你的一抗?jié)舛容^高，二抗上HRP 催化活力太強，同時你的顯色底物處于一個臨界點，反應(yīng)時間不長，將周圍底物催化完，形成了空白即“反亮現(xiàn)象”。將一抗和二抗?jié)舛冉档停蚋鼡Q新底物。
8、我的膠片是一片空白，是怎么回事？
答：如果能夠排除下面的幾個問題那么問題多半出現(xiàn)在一抗和抗原制備上。
a） 二抗的HRP 活性太強，將底物消耗光；b） ECM底物中H2O2，不穩(wěn)定，失活；c） ECL底物沒覆蓋到相應(yīng)位置；d） 二抗失活。
答：靈敏，可達(dá)ng級，用Ecl顯色法理論上可達(dá)pg 級。方便，特異性高。
2、為什么我的細(xì)胞提取液中沒有目標(biāo)蛋白？
答：原因有很多: a） 你的細(xì)胞中不表達(dá)這種蛋白質(zhì)，換一種細(xì)胞；b） 你的細(xì)胞中的蛋白質(zhì)被降解掉了，你必需加入PMSF，抑制蛋白酶活性；c） 你的抗體不能識別目標(biāo)蛋白，多看看說明，看是否有問題。
3、我的細(xì)胞提取液有的有沉淀，有的很清亮，為什么呢？
答： a） 有沉淀可能因為你的蛋白沒有變性*，可以適當(dāng)提高SDS 濃度，同時將樣品煮沸時間延長， b） 也不排除你的抗原濃度過高，這時再加入適量上樣緩沖液即可。
4、我做的蛋白質(zhì)分子量很小（10KD），請問怎么做WB？
答：可以選擇0.2μml的膜，同時縮短轉(zhuǎn)移時間。也可以將兩張膜疊在一起，再轉(zhuǎn)移。其他按步驟即可。
5、我的目的帶很弱，怎么加強？
答：可以加大抗原上樣量。這是zui主要的。同時也可以將一抗稀釋比例降低。
6、膠片背景很臟，有什么解決方法？
答：減少抗原上樣量，降低一抗?jié)舛龋淖円豢狗跤龝r間，提高牛奶濃度。
7、目標(biāo)帶是空白，周圍有背景，是為什么？
答：你的一抗?jié)舛容^高，二抗上HRP 催化活力太強，同時你的顯色底物處于一個臨界點，反應(yīng)時間不長，將周圍底物催化完，形成了空白即“反亮現(xiàn)象”。將一抗和二抗?jié)舛冉档停蚋鼡Q新底物。
8、我的膠片是一片空白，是怎么回事？
答：如果能夠排除下面的幾個問題那么問題多半出現(xiàn)在一抗和抗原制備上。
a） 二抗的HRP 活性太強，將底物消耗光；b） ECM底物中H2O2，不穩(wěn)定，失活；c） ECL底物沒覆蓋到相應(yīng)位置；d） 二抗失活。
9、我在顯影液中顯影1分鐘和5分鐘后,底片漆黑一片,是什么原因呢?
答：a） 可能是紅燈造成的, 膠片本來就被曝光了，可以在*黑暗的情況下操作.看是否有改善.；b） 顯影時間過長。
答：a） 可能是紅燈造成的, 膠片本來就被曝光了，可以在*黑暗的情況下操作.看是否有改善.；b） 顯影時間過長。
10、DAB好還是ECM好？
答：DAB 有毒，但是比較靈敏，是HRP zui敏感的底物；ECM結(jié)果容易控制，但被催化時靈敏度差一點，但如果達(dá)到閥值，就特別靈敏，可以檢測pg 級抗原。要看你實驗的情況
答：DAB 有毒，但是比較靈敏，是HRP zui敏感的底物；ECM結(jié)果容易控制，但被催化時靈敏度差一點，但如果達(dá)到閥值，就特別靈敏，可以檢測pg 級抗原。要看你實驗的情況
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