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活細胞間接免疫熒光法

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一.實驗器材:

1. 器材:

40孔塑料板、40孔板離心機、微量加樣器、振蕩器、蓋玻片、熒光顯微鏡等。

2. 試劑:

單抗隆抗體(單抗)、熒光標記抗鼠免疫球蛋白、PBS(pH7.2-7.4)、甘油、疊氮鈉(NaN3)等。

二.方法(微量法)

1. 將分離好的單個核細胞用PBS洗2次,1000rpm每次10分鐘。用含0.1% NaN3 PBS調細胞濃度在0.5-1×108/ml(5000萬-1億/ml),加在40孔板上,每孔10ul,含5-10×105細胞,然后加入單抗(*抗 體)50ul(同時加入AB型血清5ul)振蕩混勻,置4℃,至少30分鐘。

2. 用含0.1%NaN3的PBS洗一次,1000rpm離心3-5分鐘棄上清。

3. 加熒光標記抗鼠抗體(第二抗體)工作液20ul,混勻振蕩置4℃/30分鐘(時間不能超過)。

4. 用含0.1%NaN3的PBS洗2次,方法同上,棄上清,加入含60%甘油的PBS5-10ul(依據所加細胞量而定)振蕩均勻,點片,并加蓋玻片。

如想次日看結果可在第三步后每孔加入1%多聚甲醛PBS每孔50ul,混勻置4℃過夜,次日離心棄上清按四步做法觀察結果(為膜熒光)。

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