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2012-5-18 閱讀(5718)
一、實驗原理
限制性內切酶是一類能識別雙鏈DNA分子中特異核苷酸序列的DNA水解酶，主要存在于原核生物中。根據限制酶的識別切割特性、催化條件及是否具有修飾酶活性可分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大類。其中Ⅱ類酶在分子克隆和基因操作中zui為有用，是常用的分子生物學工具酶。
限制性內切酶識別序列長度一般為4～8個呈回文序列的特異核苷酸對。一般情況下，識別序列越長，在同一DNA分子中識別位點出現的頻率就越小。許多限制性內切酶的酶切位點已被確定。例如EcoRl 酶的識別與切割序列為以下6個堿基對。
5′……GAATTC……3′
3′……CTT AAG…… 5′
EcoR I以*的方式識別并裂解這個順序，形成兩個5′突出末端：
和
……G AATTC……
……CTT AA G……
這些末端為互補的，即粘性末端，并可在連接酶的催化下與由EcoR I產生的其它分子末端相連接。
限制性內切酶主要用于基因組DNA的片段化、重組DNA分子的構建與鑒定、載體中目的基因片段的分離與回收以及DNA分子物理圖譜的構建等。根據酶切目的和要求不同，可有單酶切、雙酶切或部分酶切等不同方式。根據酶切反應的體積不同，可分為小量酶切反應和大量的酶切反應。小量酶切反應主要應用于質粒的酶切鑒定，體積為20 μl, 含0.2～1 μg DNA，大量酶切反應用于制備目的基因片段，體積為50～100 μl，DNA用量在10～30ug。
本實驗為EcoR I對質粒pUC18的小量酶切。 在質粒的雙鏈環狀DNA分子上有多個限制性內切核酸酶酶切位點。在用特定的限制性內切核酸酶對質粒進行酶切反應后，通常可采用瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定酶切效果。
二、儀器與試劑
1.儀器：
水浴鍋、離心管、移液器、吸頭、 電泳設備等。
2.試劑：
質粒pUC18、EcoR I限制性內切核酸酶、內切酶反應緩沖液、瓊脂糖、電泳緩沖液、6×上樣緩沖液、溴化乙啶染液、無菌水等。
三、操作步驟
1．限制性內切酶反應一般在滅菌的0.2或0.5ml PCR薄壁離心管中進行。
2. 酶切反應體系（10ul）：
酶解緩沖液（10×buffer） 1 ul
限制性內切酶 0.5 ul EcoR I（7.5U）
底物DNA（質粒） x ul（依質粒濃度而定）
滅菌ddH2O 加至10 ul
限制性內切酶zui后加入，手彈混勻或用吸頭輕輕上下吹吸，混勻后6000 r/min，離心15s。37℃水浴消化2h。
3.酶切完畢，取5ul酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳，鑒定酶切反應效果，必須用DNA分子量標準物同時進行電泳以確定DNA的片段的大小。如果酶切不*，可繼續.酶解消化反應，或加入適量酶后繼續反應。
5. 經電泳觀察酶切反應*后，將上述反應液置65℃水浴中10～15min，中止酶切反應，將剩余酶切產物保存于?C20℃備用。
四、注意事項
1.限制性內切酶需保存于-20℃，操作時應將酶保持在冰浴中，避免長時間置于高溫中。
2. 限制性內切酶溶液通常含有50%甘油，加入反應管后，因密度較大，往往沉淀至溶液底部，所以要充分搖勻。
3. 加樣時吸頭垂直進入試劑管，避免碰到管壁，每加完一樣要換一個吸頭，同時在已加的樣品前做個記號以防止錯加或漏加，避免污染。
4. 酶（置于冰盒上）應zui后加入，盡量減少室溫接觸機會。加酶時吸頭深入不可過深。
5. 酶解消化反應溫度及時間根據該酶使用說明書而定。
6. 注意酶的用量，加入的酶量按1-3U/ug DNA計算，酶的體積應低于反應總體積的10%，以避免酶液中甘油干擾反應 。酶量過大（≥25U/ug DNA）時，有產生所謂星號活性的可能，即在識別序列以外的位點進行切割。此外，反應體系中甘油的質量分數大于12%，以及缺少NACL和存在M等情況下，都有可能出現星號活性。
五、相關問題
1.酶的保存
不同的限制酶往往保存在大致相似的緩沖液中，這種特定配方的緩沖液能使酶活性維持較長時間。常用的保存緩沖液各組分作用如下：
Tris-HCl （7.4―7.8）： 維持穩定的pH范圍。
50-100mmol/L NaCl或KCl：提供一定的離子強度。
0.1mmol/L EDTA： 絡合掉能激活限制酶的鎂離子。
1mmol/L DTT： 保護酶分子上的還原性基團。
200-500ug/ml BSA： 牛血清白蛋白提高溶液中蛋白質的濃度，防止蛋白質分子濃度過低而導致酶分子變性。
50%的甘油： 使酶液保存于-20℃不至凍結。
1-5 g/L的Triton-100： 這是一種非離子型表面活性劑，能防止蛋白質分子的表面變性作用。
2. 酶單位的定義
限制酶的單位通常定義為：1U的酶能在約50ul合適的反應緩沖體系中，在1h內完成酶切1ug的λDNA。確定限制酶單位的具體操作方法是分別向1ug的底物中加入一系列的酶（1U左右），當電泳觀察到酶切片段的條帶不再發生變化時說明已作用*，*切割的zui少酶量定為1U的酶量。
3. 限制酶的作用條件
限制酶切割DNA的反應中，酶切條件是實驗成功的重要因素，其中包括反應的溫度、時間與反應的緩沖體系，除了這些條件外，DNA的純度與濃度也會影響酶切效果，只有在正確選擇酶反應條件時才能達到*酶切效果。
（1）作用溫度
早期的酶切反應都在37℃進行，這種方法雖然簡單、統一，但卻不能達到每個酶的zui適反應溫度。為了達到*酶切的效果，根據所選用的酶確定所需要的反應溫度。
（2）緩沖體系
限制酶反應的緩沖體系大致相同，都含有以下組分：約100mmol/L的Tris-HCl，作用是將酶反應體系的pH維持在7.5-8.5；約10mmol/L的MgCl2，作用是為限制酶提供激活因子；1mmol/L的DTT，作用是保護還原性基團；約150mmol/L的NaCl，作用是提供合適的離子強度。由于認識的局限性，早期的限制酶反應體系僅根據其中NaCl含量的不同分為高鹽、中鹽與低鹽三種，這同樣不能使每種酶獲得zui適反應條件。現在提供酶的很多廠商能提供4-10種緩沖體系，其中各必需成分之間只有很小的差別，目的是使每種酶都發揮zui大的作用。
緩沖液一般配成10倍的濃度，使用時以1/10的比例加入，當然為了減小吸量誤差也可自行配制5倍的緩沖液。
（3） 反應體積與時間
酶反應體積一般不宜小于20ul。因為過小的反應體積在加入各種成分時易產生誤差，甘油含量易超過10%。在37℃保溫可因水分蒸發而明顯改變反應體系中各成分的濃度，從而影響酶活力。同時還要考慮反應完畢進行電泳時，所加樣品中DNA的量能夠在電泳中顯出清晰的泳帶。
常規的酶切反應一般控制在60min內進行，但也可以根據切割對象與所用的酶將保溫時間延長至十幾個小時。
（4） DNA的純度與濃度
除了上述酶反應條件外，影響酶切效果的zui主要因素是DNA的純度。例如，樣品中含有大量RNA雜質時會因減少了酶的有效濃度而影響酶切效果；某些雜蛋白未除凈而結合在DNA時也會影響酶切效果。。至于抽提過程中未除凈的各種影響因素就更多了，可能是微量的氯仿、SDS、EDTA、酚、EB、乙醇或是瓊脂糖凝膠中的硫酸根離子等。
DNA純度的另一個指標是不可含有微量的DNA酶。如果酶切后電泳結果顯示出不清晰條帶或成為一片紅色（術語稱Smear）時，可肯定系統中已經污染了DNA酶。
DNA樣品中含有大量RNA時可用RNA酶處理；含有結合在DNA上的雜蛋白與DNA酶時都可用氯仿/異戊醇抽提；當樣品中含有氯仿、SDS、硫酸根等抑制酶切的小分子物質時可以通過沉淀更換一個新的緩沖體系。當然，酶切失敗時也不能排除除DNA外的一切因素，如無菌水，EP管，吸咀等的干凈程度以及內切酶自身的酶活性情況。
除純度外，DNA的濃度也會影響酶切效果，一般DNA質量濃度在1ug/20ul才能得到較好的酶切效果，質量濃度高達1.5ug/20ul時就可能發生酶切困難。
（5）終止酶切反應的方法
如果需對酶切片段進行連接或標記等操作時，首先要將限制酶滅活。滅活的方法可分為三種：*種是向反應緩沖體系中加入終濃度為10-12.5mmol/L的EDTA，原理是絡合掉酶反應中所需的鎂離子。但這種方法會影響需鎂離子的后續反應。所以一般加入EDTA后，要用乙醇沉淀法來更換緩沖體系，以除去EDTA，但這樣就會造成DNA的損失。第二種方法是熱失活：一般的酶如EcoRⅠ等在65℃保溫60min即可；另一些酶如Hind Ⅲ等需在85℃保溫30min方能達到目的；的例子是Ttb Ⅲ甚至不能用加熱的方法使之失活。熱失活方法的特點是簡單并且未向體系中引入任何物質，特別適用于連續進行幾個酶切反應；熱失活法的另一個特點是不用更換體系，所以不會造成DNA的損失。第三種方法是用酚和氯仿抽提使之失活，之后以乙醇沉淀DNA的片段。這種方法的特點是處理條件劇烈，能使酶*失活（不像*種方法中酶蛋白并未變性而只是沒有激活因子而已）。
