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ELISA實驗的技術(shù)要點（二）
閱讀：1416 發(fā)布時間：2019-7-30你是否在為做實驗的時候沒有掌握到要點而擔(dān)心？沒關(guān)系上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司來告訴你。ELISA 的技術(shù)要點包括三個方面：試劑的制備、反應(yīng)條件的選擇和操作的標(biāo)準(zhǔn)化。
一、反應(yīng)條件的選擇、適工作濃度的選擇
在建立某一 ELISA 測定中，應(yīng)對包被抗原或抗體的濃度和酶標(biāo)抗原或抗體的濃度予以選擇，以達(dá)到合適的測定條件和節(jié)省測定費用。下面以間接法測抗體和夾心法測抗原為例，介紹適工作濃度的選擇方法。
（一）間接法測抗體
1．酶標(biāo)抗抗體工作濃度的選擇
（1）用100ng/ml人IgG進(jìn)行包被，洗滌。
（2）將酶標(biāo)抗人IgG用稀釋液作一系列稀釋后分別加入已包被的孔中，保溫，洗滌。
（3）加底物顯色。加酸終止反應(yīng)后，讀取吸光度（A），繪制曲線如圖15-10。讀取A值在 1.0 時的酶標(biāo)抗體稀釋度，作為酶標(biāo)抗體的工作濃度。該酶標(biāo)抗人 IgG 的工作濃度應(yīng)為1/1600。
2.棋盤滴定法選擇包被抗原工作濃度
（1）用包被液將抗原作一系列稀釋后進(jìn)行包被，洗滌。
（2）將強(qiáng)陽性參考血清、弱陽性參考血清和陰性參考血清用稀釋液作1:100稀釋，加樣，保溫，洗滌。
（3）加按工作濃度稀釋的酶標(biāo)抗人IgG抗體，保溫，洗滌。
（4）加底物顯色。加酸終止反應(yīng)后讀取A值。
（5）選擇強(qiáng)陽性參考血清的A值為0.8左右、陰性參考血清的A值小于0.1的包被抗的的稀釋度作為工作濃度。表15-1為本例的測定結(jié)果，表中數(shù)字為A值。從表中可見1:200為zui舒適的工作濃度。
各類血清 抗原稀釋度
1:50 1:100 1:200 1:400 1:800
強(qiáng)陽性 1.20 1.04 0.84 0.68 0.42
弱陽性 0.64 0.41 0.30 0.22 0.19
陰性 0.23 0.13 0.08 0.66 0.05
稀釋液 0.09 0.02 0.02 0.02 0.04
（二）夾心法測抗原
在夾心法 ELISA 法中可用棋盤滴定法同時選擇包被抗體和酶標(biāo)抗體的工作濃度，舉例如下：
夾心 ELISA 包被抗體和酶標(biāo)抗體工作濃度的選擇
包被抗體的濃度及 參考抗原
酶標(biāo)抗體稀釋度 強(qiáng)陽性（25ng/ml）弱陽性（1.5ng/ml）陰性
10 μg/ml
1:1000 1.17 0.15 0.09
1:5000 0.46 0.03 0
1:25000 0.12 0 0
1 μg/ml
1:1000 ＞2 0. 25 0.10
1:5000 0.91 0.12 0.01
1:25000 0.25 0.01 0
0.1 μg/ml
1:1000 0.42 0.13 0.13
1:5000 0.11 0.03 0.02
1:25000 0.03 0 0
（1）抗體免疫球蛋白用包被緩沖液稀釋至蛋白濃度為 10、1 和 0.1 μg/ml，分別在 ELISA 板上進(jìn)行包被，每一濃度包括三個縱行，洗滌。
（2）在一個橫行各包被孔中加入強(qiáng)陽性抗原液，另一橫行加入弱陽性抗原液，第三橫行加入陰性對照液，保溫，洗滌。
（3）將酶標(biāo)抗體用稀釋液稀釋成三個濃度，例如 1:1000、1:5000 和 1:25000。分別加入每一包被濃度的一個縱行中，保溫，洗滌。
（4）加底物顯色。加酸終止反應(yīng)后，讀取 A 值。
（5）以強(qiáng)陽性抗原的 A 值在 0.8 左右、陰性參考的 A 值小于 0.1 的條件作適條件，據(jù)此選擇包被抗體和酶標(biāo)抗體的工作濃度。從表 15-2 可看出包被抗體濃度可選用 1 μg/ml，酶標(biāo)抗體的稀釋度可選為 1:5000。為了進(jìn)一步節(jié)省試劑，可以此濃度為基點，縮小間距再做進(jìn)一步的棋盤滴定。
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