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怎么從 -80℃ 凍存的抗凝全血中提取RNA
閱讀：2515 發(fā)布時間：2020-7-1實驗材料：
-80℃ 冷凍 75 天的抗凝全血；預(yù)先按 500 µl 血樣比 1 ml Buffer L9 的比例加入 Buffer L9 的同一個抗凝全血樣本作為對照組（備注：Simgen 全血總 RNA 試劑盒中的 Buffer L9 與抗凝全血預(yù)混后可在-20℃ 長期凍存，RNA 不會降解）。
實驗試劑：
全血總 RNA 試劑盒（simgen，Cat.No.5201050）、
cDNA 鏈合成試劑盒（simgen，Cat.No.7306025）、
2×SYBR Green PCR Mix（simgen，Cat.No.7106100）、
人 β-actin 引物（Forward TGACGTGGACATCCGCAAAG
/Reverse： CTGGAAGGTGGACAGCGAGG）
實驗方法：
1. 分兩組進行對比實驗，每組各做兩管：第fist組取 2 個 2 ml 離心管，各加入 500 µl 新鮮全血，編號 1、2；第二組加入 500 µl 新鮮全血后再加入 1 ml Buffer L9，混合均勻，編號 3、4。將兩組樣本置于 -80℃ 凍存，凍存 75 天。
2. 75 天后取出后置于室溫，待血樣全部融化后，向 1、2 中加入 1 ml Buffer L9 混合均勻；
3. 13000 rpm 離心 10 分鐘；
4. 吸取 700 µl 離心上清轉(zhuǎn)移到裝有 500 μl 無水乙醇的 1.5 ml 離心管中，混勻；
5. 分兩次將混合液轉(zhuǎn)移到核酸純化柱中，離心去濾液；
6. 依次用 500 µl Buffer WA 和 700 µl Buffer WBR 各洗滌一次；
7. 用 50 µl RNase-Free Water 洗脫 RNA；
8. 在微量紫外分光光度計上測量 RNA 的濃度；
9. 瓊脂糖凝膠電泳；
10.逆轉(zhuǎn)錄制備 cDNA；
11.取 5 μl cDNA 模板進行 RT-PCR 檢測。
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