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進(jìn)口PCR實(shí)驗(yàn)原理及反應(yīng)要素介紹
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)
一、發(fā)展簡(jiǎn)史
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction,PCR）是一種用于放大擴(kuò)增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)，它可看作是生物體外的特殊DNA復(fù)制，PCR的特點(diǎn)，是能將微量的DNA大幅增加。因此，無(wú)論是化石中的古生物、歷史人物的殘骸，還是幾十年前兇殺案中兇手所的毛發(fā)、皮膚或血液，只要能分離出一丁點(diǎn)的DNA，就能用PCR加以放大，進(jìn)行比對(duì)。這也是"微量證據(jù)"的威力之所在。
1983年美國(guó)Mullis首先提出設(shè)想，1985年由其發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng)，即簡(jiǎn)易DNA擴(kuò)增法，意味著PCR技術(shù)的真正誕生。
二、實(shí)驗(yàn)原理
類似于DNA的體內(nèi)復(fù)制。
首先待擴(kuò)增DNA模板加熱變性解鏈，隨之將反應(yīng)混合物冷卻至某一溫度，這一溫度可使引物與它的靶序列發(fā)生退火，再將溫度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。這種熱變性-復(fù)性-延伸的過(guò)程就是一個(gè)PCR循環(huán)。
PCR過(guò)程是由變性，退火，延伸3個(gè)步驟組成的不斷重復(fù)的過(guò)程。標(biāo)準(zhǔn)的PCR過(guò)程分為三步：
1.DNA變性（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈DN
2.退火（復(fù)性）（40℃-65℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部雙鏈。
3.3.延伸（68℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右的活性）的作用下，以dNTP為原料，從引物的5′端→3′ 端延伸，合成與模板互補(bǔ)的DNA鏈。
每一循環(huán)經(jīng)過(guò)變性、退火和延伸，DNA含量既增加一倍。
三、PCR反應(yīng)要素：
- DNA模版：可以是雙鏈、單鏈、提取染色體的DNA、克隆的質(zhì)粒DNA，
- 引物：一對(duì)寡聚DNA，分別與模板兩側(cè)的3’端序列互補(bǔ)，可使DNA序列得到擴(kuò)增
- DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶）：催化DNA合成，
- 緩沖液：提供DNA合成反應(yīng)所需的PH,離子強(qiáng)度等環(huán)境
- 4種單核苷酸：dNTP,提供DNA合成原料
- 實(shí)驗(yàn)材料
PCR擴(kuò)增儀、PCR反應(yīng)管、PCR離心管、移液器、凝膠電泳設(shè)備、冰盒、離心機(jī)
模板、PCR引物、TaqDNA聚合酶、dNTP反應(yīng)緩沖液、Mg2+、ddH2O。
- PCR反應(yīng)體系
- 以DNA為模板的反應(yīng)體系：
模板：DNA102~105拷貝
引物
底物：4種dNTP
TaqDNA聚合酶
緩沖液
體積：
- 以mRNA為模板的反應(yīng)（逆轉(zhuǎn)錄PCR）
模板：RNA
引物：oligo(dT)12~18
底物：4種dNTP
逆轉(zhuǎn)錄酶
緩沖液
其他試劑：RNA酶抑制劑，MgCl2.DTT.