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介紹實時熒光定量pcr儀的技術原理
閱讀：1049 發布時間：2022-7-11
實時熒光定量pcr儀，由熒光定量系統和計算機組成，用來監測循環過程的熒光。與實時設備相連的計算機收集熒光數據。數據通過開發的實時分析軟件以圖表的形式顯示。原始數據被繪制成熒光強度相對于循環數的圖表。原始數據收集后可以開始分析。實時設備的軟件能使收集到的數據進行正常化處理來彌補背景熒光的差異。正常化后可以設定域值水平，這就是分析熒光數據的水平。
PCR反應過程中產生的DNA拷貝數是呈指數方式增加的，隨著反應循環數的增加，終PCR反應不再以指數方式生成模板，從而進入平臺期。在傳統的PCR中，常用凝膠電泳分離并用熒光染色來檢測PCR反應的終擴增產物，因此用此終點法對PCR產物定量存在不可靠之處。在real-timeQ-PCR中，對整個PCR反應擴增過程進行了實時的監測和連續地分析擴增相關的熒光信號，隨著反應時間的進行，監測到的熒光信號的變化可以繪制成一條曲線。在PCR反應早期，產生熒光的水平不能與背景明顯地區別，而后熒光的產生進入指數期、線性期和終的平臺期，因此可以在PCR反應處于指數期的某一點上來檢測PCR產物的量，并且由此來推斷模板初的含量。為了便于對所檢測樣本進行比較，在real-timeQ-PCR反應的指數期，首先需設定一定熒光信號的域值，一般這個域值（threshold）是以PCR反應的前15個循環的熒光信號作為熒光本底信號（baseline），熒光域值的缺省設置是3～15個循環的熒光信號的標準偏差的10倍。如果檢測到熒光信號超過域值被認為是真正的信號，它可用于定義樣本的域值循環數（Ct）。Ct值的含義是：每個反應管內的熒光信號達到設定的域值時所經歷的循環數。研究表明，每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數的對數存在線性關系，起始拷貝數越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數的標準品可作出標準曲線，因此只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數。