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總膽固醇(TC)含量檢測試劑盒說明書
注意:正式測定之前選擇 2-3 個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。
規(guī)格:100T/96S 產(chǎn)品簡介:
微量法
總膽固醇(Total Cholesterol,TC)是指所有脂蛋白所含膽固醇的總和,包括游離膽固醇和膽固醇酯。
利用酯酶催化膽固醇酯水解生成游離膽固醇(FC)和游離脂肪酸(FFA),從而把膽固醇酯轉(zhuǎn)化為 FC;進(jìn)一步利用膽固醇氧化酶催化 FC 氧化,生成△4-膽甾烯酮和 H2O2;最后利用過氧化物酶催化H2O2 氧化 4-氨基安替比林和酚,生成紅色醌類化合物,其在 500nm 有特征吸收峰,其顏色深淺與TC 含量成正比。
試驗(yàn)中所需的儀器和試劑:
可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、天平、低溫臺式離心機(jī)、微量玻璃比色皿/96 孔板、可調(diào)式移液槍、
EP 管、蒸餾水、異丙醇。產(chǎn)品內(nèi)容:
提取液:異丙醇 100mL×1 瓶,自備,4℃保存;
工作液:液體 30mL×1 瓶,4℃保存;
標(biāo)準(zhǔn)品:粉劑×1支,10mg膽固醇,4℃保存。臨用前加入517μL提取液,振蕩溶解,即為50μmol/mL 的膽固醇標(biāo)準(zhǔn)溶液。
操作步驟:
一、樣本處理:
1.組織:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為 1:5~10 的比例(建議稱取約 0.1g 組織,加入 1mL
提取液)進(jìn)行冰浴勻漿。10000g,4℃離心 10min,取上清置冰上待測。
2.細(xì)菌、真菌:按照細(xì)胞數(shù)量(104 個):提取液體積(mL)為 500~1000:1 的比例(建議 500 萬細(xì)胞加入 1mL 提取液),冰浴超聲波破碎細(xì)胞(功率 300w,超聲 2 秒,間隔 3 秒,總時(shí)間 3min);然后 10000g,4℃離心 10min,取上清置于冰上待測。
3.血清(漿)樣品:直接測定。二、測定步驟:
1、 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上,調(diào)節(jié)波長至 500nm,蒸餾水調(diào)零。
2、 將 50μmol/mL 標(biāo)準(zhǔn)液用提取液稀釋為 2.5、1.25、0.625、0.3125、0.15625、0.078μmol/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。
3、 操作表:(在離心管或 96 孔板中依次加入下列試劑)
第 1 頁 共 2 頁
測定管標(biāo)準(zhǔn)管空白管
樣品(µL)20--
標(biāo)準(zhǔn)溶液(μL)-20-
提取液(μL)--20
工作液(µL)180180180
充分混勻,37℃靜置 15min,反應(yīng)完成后測定 500nm 處吸光值 A,分別記為 A 測定管、A 標(biāo)準(zhǔn)管和 A 空白管,△A=A 測定管-A 空白管,△A 標(biāo)準(zhǔn)=A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管, 空白管只需測一次。
總膽固醇含量計(jì)算
一、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:
以各個標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為 x 軸,其對應(yīng)的△A 標(biāo)準(zhǔn)為 y 軸,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到標(biāo)準(zhǔn)方程 y=kx+b, 將△A 帶入方程得到 x(μmol/mL)
二、總膽固醇含量的計(jì)算:
1.血清(漿)中 FC 含量計(jì)算:
TC 含量(μmol/dL)=x×100。
2.組織中 FC 含量計(jì)算:
1.按樣本蛋白濃度計(jì)算
TC 含量(μmol/mg prot)=x×V 提取÷(Cpr×V 提取)=x÷Cpr。
2.按樣本鮮重計(jì)算
TC 含量(μmol/g 鮮重)=x×V 提取÷W= x÷W
3.細(xì)胞、細(xì)菌中 TC 含量計(jì)算:
TC 含量(μmol/104 cell)=x×V 提取÷500=0.002x。
100:1dL=100mL;V 提取:加入樣本的提取液體積,1mL;W:樣本質(zhì)量,g;500:500 萬個細(xì)胞數(shù)量。
注意事項(xiàng)
當(dāng)△A 大于 1.5 時(shí),建議將樣本用提取液稀釋后再進(jìn)行測定。
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實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù):
實(shí)驗(yàn)室代做實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目
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細(xì)胞熒光染料標(biāo)記檢測實(shí)驗(yàn)
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染色質(zhì)免疫沉淀分析(CLIP)實(shí)驗(yàn)服務(wù)
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