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逆轉錄酶（RT-PCR）實驗操作流程及注意事項
閱讀：1121 發布時間：2023-4-23逆轉錄酶(RT-PCR)是存在于 RNA 病毒體內的依賴 RNA 的 DNA 聚合酶。RT-PCR 實驗中的逆轉錄酶需要具有以下三種活性：
1. 依賴 RNA 的 DNA 聚合酶活性：以 RNA 為模板合成 cDNA 的第一條鏈；
2. Rnase 水解活性：水解 Rnase 雜合體中的 RNA;
3. 依賴 DNA 的 DNA 聚合酶活性：以一條 DNA 鏈為模板合成互補的雙鏈 DNA。
在選擇逆轉錄酶時，建議選擇無 RNaseH①活性（RNaseH-）的逆轉錄酶。具有 RNaseH 活性的逆轉錄酶的 RNaseH 活性會與聚合酶活性競爭 RNA 模板與 DNA 引物（或 cDNA 延伸鏈）形成的雜合鏈，并降解雜合鏈中的 RNA 鏈。被 RNaseH 活性所降解的 RNA 模板不能再作為合成 cDNA 的有效底物，降低了 cDNA 合成的產量與長度。
一、實驗流程：
1、從細胞材料中提取 RNA→RNA 加入到含有逆轉錄酶、引物、dNTPs 的反應體系中→退火，引物與 RNA 鏈配對→延伸，逆轉錄酶合成互補 cDNA 鏈變性→常規 PCR 反應流程（變性、退火、延伸，如此多次循環）。
2、RT-PCR“兩步法"與“一步法"
RT-PCR 的實驗操作分為“一步法"與“兩步法"兩種。一步法 RT-PCR 能克隆微量 mRNA 而不需構建 cDNA 文庫（即 cDNA 合成與 PCR 反應在同一 Buffer 及酶中進行，一步法完成），省略了 cDNA 與 PCR 之間的過程。兩步法 RT-PCR 首先用反轉錄酶合成 cDNA，然后以 cDNA 為模板進行 PCR，即 RNA 反轉錄與 PCR 擴增分兩步進行。一步法 RT-PCR 與兩步法相比快速、簡便、減少了污染機會、減少了 RNA 二級結構、減少了 PCR 反應的錯配率。RT-PCR 兩步法的優勢在于存在中間產物 cDNA，便于保存；且第二步 PCR 只取逆轉錄反應產物的 1/10 進行反應，有利于 PCR 條件的調整，實驗重現性強；兩步法可以在第二步 PCR 反應體系中加入特異性引物，其靈敏度比一步法高；兩步法的實驗預算要低于一步法。但是由于兩步法包括第一鏈 cDNA 合成和隨后的 PCR 反應，容易產生污染問題。
二、實驗操作注意事項：
1、 RNA 提取一定要迅速，樣本要新鮮，組織盡量在液氮中研磨；
2、 RNA 提取完馬上進行逆轉錄不要拖延，新提的 RNA 很容易降解；
3、逆轉錄反應過程，需建立無 RNAase 環境，以避免模板 RNA 降解；