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病毒分離是診斷NDzui為確切的一種方法，并且可以為感染的毒株定性。通常采用雞胚接種的方法分離NDV，也可用鴨胚、鵪鶉胚或雞胚成纖維細胞等。病毒分離時取患病雞的腦、脾、肺等組織的勻漿混合物，加抗生素處理后，接種于雞胚或其他禽類胚的尿囊腔或雞胚成纖維細胞中。組織樣品須反復凍融3次以上，以確保病毒分離的成功。病料接種雞胚后，一般培養36～96h雞胚發生死亡，可見胚體的頭、翅、頸、胸等處出血，尿囊液清朗，內含大量病毒，呈現較高的血凝性。分離病毒時還應結合相應的血凝和血凝抑制試驗等方法進行檢測，以便使結果更加可靠。病毒分離后需要進一步測其雞胚平均死亡時間（MDT）、腦內致病指數（1CPl）、靜脈致病指數（1VPD等一系列生物學指標。
該方法用于診斷ND，準確、可靠，但整個過程較為繁雜，耗時較長，因此，很難在基層獸醫工作中得到廣泛應用。
（1）樣品采集 活禽用氣管拭子和泄殖腔拭子（或糞便）；死禽以腦為主；也可采心、肝、脾、腎、氣囊等組織。
（2）樣品處理 樣品用生理鹽水或磷酸鹽緩沖液（PBS）研成1；5乳液；拭子浸入2—3ml生理鹽水或PBS緩沖液中，反復吸擠壓至無水滴出，棄之。溶液中加入青霉素（使終濃度為1000單位／mi）鏈霉素（使終濃度為lmg／mi）泄殖腔拭子（或糞）樣品，青霉素、鏈霉素量提高5倍。然后調pH 7．0～7．4，37~C作用1h，再1000r／rain離心10min，取上清0．1ml備用。
（3）病毒分離和鑒定 將病料接種9～lo日齡SPF雞胚，經孵化后，檢查尿囊液是否具有血凝性（HA）以及這種血凝性能否被新城疫特異抗血清所抑制（H1）。若有血凝性（HA效價>24）且血凝性能被特異血清所抑制，則證明分離到了新城疫病毒，但該病毒并不一定是致病的強毒，也有可能是疫苗毒÷因此必須對分離到的病毒進行致病力測定。
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