對于基于半胱氨酸偶聯的ADC,若重輕鏈間二硫鍵連接上，重輕鏈之間則通過疏水相互作用連接，即使在非還原變性條件下，重輕鏈之間容易發生分離;若重鏈之間的兩對二硫鍵分別連接,同樣也容易發生分離。

反相色譜基于ADC不同組分疏水性的差異對各組分進行分離,但是反相色譜填料對于蛋白有一定的變性作用，加之流動相里存在有機溶劑及少量的有機酸，容易對ADC發生破壞作用,可以使重/輕鏈或重/重鏈發生分離,增加分析的難度。

IgGl具有4對鏈間二硫鍵,單抗通過部分還原使鏈間二硫鍵轉換成游離的半胱氨酸殘基，半胱氨酸殘基再與小分子連接形成了一-種包含0~8個復合抗體的混合物。二硫鍵還原后可產生2個游離巰基,可同時連接2個,所以一般以偶數出現,因此基于半胱氨酸偶聯的ADC一般來說為含有0,2,4,6或8個的混合物,其可能存在的形式如圖所示。

在儀器分析前，將ADC用巰基乙醇充分還原,ADC樣品則解離為0~1個的輕鏈以及帶有0~3個的重鏈,然后利用反相色譜可對各組分進行分離。

PLRP-8色譜柱能夠輕松實現對ADC各個還原片段的分離,通過質譜聯用技術，對各峰進行鑒定。通過紫外吸收光譜計算各峰的峰面積百分比，得到ADC的加權平均DAR. RP-HPLC 的方法沒有濃度鹽，不會對常規液相色譜造成污染，使用的是質譜兼容的流動相，能夠兼顧質譜定性與液相定量計算DAR。此方法不可得到DAR,還可計算帶有不同數目的重輕鏈的比例,對于基于半胱氨酸偶聯ADC的DAR及分布分析具有意義。

按照偶聯于抗體的位點分類,ADC可分為基于賴氨酸和基于半胱氨酸偶聯2種用。IgG1抗體具有4對鏈間二硫鍵和12對鏈內二硫鍵,一般來說，半胱氨酸偶聯技術只將偶聯至鏈間二硫鍵的巰基上。溫和的偶聯反應可控制ADC的抗體偶聯比(drug antibody ratio, DAR)，因為DAR是的質控參數,比例較低則降低。

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