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東曹(上海)生物科技有限公司

離子交換色譜的原理和實(shí)際操作

時(shí)間:2017-9-12 閱讀:4991
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離子交換色譜是蛋白純化技術(shù)中常用的一種純化方法,其原理是指被分離物質(zhì)所帶的電荷可與離子交換劑所帶的相反電荷結(jié)合,這種帶電分子與固定相之間的結(jié)合作用是可逆的,在改變pH或者用逐漸增加離子強(qiáng)度的緩沖液洗脫時(shí),離子交換劑上結(jié)合的物質(zhì)可與洗脫液中的離子發(fā)生交換而被洗脫到溶液中。由于不同物質(zhì)的電荷不同,其與離子交換劑的結(jié)合能力也不同,所以被洗脫到溶液中的順序也不同,從而被分離出來(lái)。

絕大多數(shù)重組蛋白純化都要用到離子交換。離子交換色譜的基礎(chǔ)是高分辨率,可以直接放大規(guī)模應(yīng)用在工業(yè)上,柱再生容易,還可以使蛋白濃縮。大多數(shù)蛋白質(zhì)的靜電荷是負(fù)值,因此陰離子交換色譜的應(yīng)用。

離子交換色譜的實(shí)際操作:

1.將超純水與沉降膠按1:3比例懸浮,輕輕攪勻;
2.將色譜柱固定到設(shè)備支架上,鏈接出口管道,從柱底端進(jìn)口反向泵入超純水,排除管道及篩板中的氣泡,停泵,然后從出口端放出部分超純水,保留1~2cm高度超純水,封死出口端,然后正向沖洗進(jìn)口端管道和適配器,排除篩板和管道中氣泡;
3.通過(guò)玻璃棒引流將懸浮膠導(dǎo)入色譜柱,在柱上端補(bǔ)充部分超純水,攪勻,裝上適配器;
4.將柱出口端與色譜設(shè)備連接,以0.2MPa恒壓裝柱,裝填至恒定的柱床高度,標(biāo)記柱床膠面位置,關(guān)閉泵,松開(kāi)適配器,降低適配器至膠面下2mm處,繼續(xù)裝填,待柱床高度穩(wěn)定后,標(biāo)記柱床膠面位置,降低適配器至柱上標(biāo)記柱床位置下2mm。固定適配器,繼續(xù)裝填2~3柱體積;
5.確定柱體積,測(cè)量柱高,計(jì)算柱體積及記錄裝柱時(shí)的zui大流速;
6.選擇*線速,用0.5mol/L NaOH沖洗柱,沖洗3~5體積;
7.接著用超純水沖柱,沖洗10柱體積,至pH顯示接近超純水pH。

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