日本同仁Annexin V,FITC 凋亡檢測試劑盒

產品名稱：Annexin V,FITC 凋亡檢測試劑盒
英文名稱：Annexin V,FITC Apoptosis Detection Kit
品牌：日本同仁化工
貨號：AD02-05
規格：盒
儲存條件：0-5℃
貨期：現貨

日本同仁Annexin V,FITC 凋亡檢測試劑盒

 

產品名稱：Annexin V,FITC 凋亡檢測試劑盒

英文名稱：Annexin V,FITC Apoptosis Detection Kit

品牌：日本同仁化工

貨號：AD02-05

規格：盒

儲存條件：0-5℃

貨期：現貨

 

細胞凋亡是指為維持有機體內環境穩定，由基因控制的細胞自主的有序的死亡。正常情況下，任何細胞在形成過程中發生的異常都會通過凋亡消除。例如，體內的癌細胞增長為腫瘤的過程會受細胞凋亡的引導而被抑制。然而，在抑癌基因p53出現問題時，凋亡就不會誘導發生，從而導致癌細胞的不斷增長。 細胞凋亡可以通過細胞形態的變化或生物化學的變化來檢測。目前常用的指標有caspase活性變化、DNA碎片、磷脂酰絲氨酸的外翻等。

Annexin V染色的細胞可以用于檢測細胞凋亡早期的細胞膜變化。在細胞凋亡早期，膜磷脂酰絲氨酸由脂膜內側翻向外側。 Annexin V是一種Ca離子依賴性磷脂結合蛋白，可以與磷脂酰絲氨酸特異結合。用綠色熒光FITC標記的Annexin V通過流式細胞儀或熒光顯微鏡可以檢測到細胞凋亡的發生。碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)是一種核酸染料，PI只能透過凋亡晚期和死細胞的細胞膜，因此Annexin V和PI結合使用，可以區分凋亡早晚期的細胞及死細胞。

 

操作流程

-懸浮細胞的操作流程

誘導凋亡的操作步驟

1.制備細胞 (Jurkat cell) 懸液 (1×106 cells/ml)

2.加入終濃度為1 ?g/ml的凋亡誘導劑 (Staurosuporine)

3.在37℃下培養3.5 h。

* Staurosuporine用于誘導Jurkat cell凋亡。*誘導條* Staurosuporine用于誘導Jurkat cell凋亡。*誘導條件請根據實驗的細胞類型與誘導劑調整。   Annexin V染色操作步驟

1. 將細胞懸液轉移到離心管中，1,000 rpm離心3 min，去除上清液。

2. 加入PBS，1,000 rpm離心 3 min，去除上清液。再重復本步操作一遍。

3. 用之前準備好的1×Annexin V Binding Solution制備細胞終濃度為1×106 cells/ml的細胞懸液。

* 細胞懸液體積根據實驗目的自行調整，一般推薦不少于500 ?l細胞懸液。

4. 取100 ?l步驟3中制備的細胞懸液，加入到一個新的tube中。

5. 向細胞懸液中加入5 ?l Annexin V,FITC結合物，再加入5 ?l PI Solution。

6. 室溫下避光培養15 min。

7. 加入400 ?l 1×Annexin V Binding Solution，請在1 h內檢測。

 

-貼壁細胞的操作流程

誘導凋亡的操作步驟

1. 制備細胞 (Caco-2) 懸液 (1×106 cells/ml)將細胞懸液接種到培養皿或者培養板中。

2. 在5% CO2培養箱中37℃預培養。

3. 加入終濃度為25 ?mol/ml的凋亡誘導劑 (Cisplatin)。

4. 37℃培養4 days。

* Cisplatin用于誘導Caco-2 cell凋亡。*的誘導條件請根據實驗的細胞類型與誘導劑調整。

Annexin V染色操作步驟

1. 吸取培養皿或培養板中的上清液丟棄或轉移至微型管中保存。

2. 用PBS洗細胞2次，丟棄或收集清洗液保存。

3. 用胰蛋白酶消化細胞。

4. 用適量的培養基或PBS將細胞懸液轉移至離心管中，如果*步的上清液和第二步的清洗液沒有丟棄，可以一并加入。

5. 1,000 rpm離心3 min，棄上清。

6. 加入PBS后1,000 rpm離心3 min，棄上清。重復本步操作一遍。

7. 加入預先配好的1×Annexin V Binding Solution，制成終濃度為1×106 cells/ml的細胞懸液。

* 細胞懸液體積根據實驗目的自行調整，一般推薦不少于500 ?l細胞懸液。

8. 取100 ?l步驟7中的細胞懸液，加入到新的tube中。

9. 向細胞懸液中加入5 ?l Annexin V, FITC結合物，再加入5 ?l的PI Solution。

10. 室溫下避光培養15 min。

11. 加入400 ?l 1×Annexin V Binding Solution，請在1 h內檢測。

備注：1. 上清液及清洗液中可能含有細胞或凋亡細胞，可以收集一起處理。

      2. 離心后如果無法判斷tube中是否含有細胞？可以保留上清液，以防檢測時沒有細胞，進而得不到實驗結果。

-設定對照

1. 未染色細胞。

2. Annexin V, FITC染色細胞 (沒有PI)。

3. PI染色細胞 (沒有Annexin V-FITC)。

-流式細胞儀檢測

1. 加樣到流式細胞儀檢測，激發波長Ex = 488 nm；發射波長Em = 530 nm。

2. Annexin V-FITC的綠色熒光通過FITC通道 (FL1) 檢測；PI的紅色熒光通過PI 通道 (FL2或FL3) 檢測 (建議使用FL3)。

-熒光顯微鏡檢測

  將細胞懸液滴到玻片上，置于顯微鏡上使用合適的濾光片檢測。

* 由于EDTA會對細胞膜的特定部位有損傷，建議使用不含EDTA的胰酶消化貼壁細胞。

注意事項

1. PI有潛在的致癌性，操作時請特別注意并采取必要的防護措施。

2. Annexin V,FITC和PI均對光敏感。所有染色過程和培養過程均需避光。

3. 若細胞收集過程中使用胰酶，需設法去除殘留的胰酶，這些胰酶會消化并降解Annexin V, FITC，zui終導致染色失敗。