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乳酸脫氫酶基本化學反應及常見測試辦法

閱讀:3085          發布時間:2013-7-29

乳酸脫氫酶基本化學反應及常見測試辦法 
  乳酸脫氫酶是一種糖酵解酶。乳酸脫氫酶存在于機體所有組織細胞的胞質內,其中以腎臟含量較高。乳酸脫氫酶是能催化乳酸脫氫丙酮酸的酶,幾乎存在于所有組織中。同功酶有五種形式,即LDH-1(H4)、LDH-2(H3M)、LDH-3(H2M2)、LDH-4(HM3)及LDH-5(M4),可用電泳方法將其分離。LDH同功酶的分布有明顯的組織特異性,所以可以根據其組織特異性來協用診斷疾病。正常人血清中LDH2,>LDH1。如有心肌酶釋放入血則LDH1>LDH2,利用此指標可以觀察診斷心肌疾病。

  英文名稱:LAD;LDH;Lactic dehydrogenase(rabbit muscle)
其他名稱:L-乳酸脫氫酶;乳酸去氫酵素
CAS號:9001-60-9

級別:BR
分子量:約36000
活力:≥300u/mg protein

活力定義:One unit will reduce 1.0 μmole of pyruvate to L-

lactate per min at pH 7.5 at 37℃
濃度:≥5000u/ml
性狀:懸浮液。酶反應:乳酸鹽+輔酶I=丙酮酸鹽+還原輔酶I+H+ 。等

電點pI 4.6。在25℃,pH 5.0~11.0時穩定;在pH小于5時,120分鐘后沒

有活力(放置同樣時間,在pH 5.0時有100%活力,在pH 6.0時有84%活力)
用途:生化研究。丙酮酸鹽的檢定
保存:2~8℃
乳酸脫氫酶(1actate dehydrogenase,LDH)是輔酶I(NAD)依賴性脫氫酶,能氧化乳酸為丙酮酸,為無氧糖酵解途徑的標志酶。硝基藍四唑鹽法顯示LDH活性的原理與顯示SDH活性的原理基本相同,只是需加用NAD,氫從反應的還原型輔酶I(NADH)傳遞給四唑鹽,將其還原為甲脂。
 
    1)孵育液配制
    0.06mol/LPBS           0.25ml
    1.0mol/LD,L乳酸鈉     0.1ml
    0.4%NAD              0.1ml
    0.4%NBT               0.25ml
    0.1mol/LKCN            0.1ml
    0.5mol/LMgCl:          0.1ml
    蒸餾水                   10ml
 
    2)操作程序:
    ①固定:用預冷的2%多聚甲醛(0.1mol/LPBS,pH 7.4配制)灌注固定5分鐘;
    ②洗滌:用冷PBS灌流沖洗固定液;
    ③取材:取所需組織,用PBS洗3次;
    ④切片:冰凍切片或振動切片,裱于涂有黏附劑的載玻片上:
    ⑤孵育:在上述孵育液中,暗處反應5分鐘,室溫下反應30分鐘;
    ⑥封片:洗滌、脫水、甘油明膠封固和鏡檢。
 
    3)結果:酶反應陽性部位呈藍色。該酶對固定劑的耐受性較好,采用先固定后孵育,可保存結構防止酶擴散。為了防止定位異常,在底物中加入聚乙烯醇(PVA)或聚乙烯吡咯烷酮(PVP),可使底物黏稠度增加,防止反應產物擴散。
 
    4)對照實驗:除去孵育液中的底物,結果應為陰性。

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