您好, 歡迎來到化工儀器網(wǎng)
PICK ME UP！干細胞挑取的C位技術(shù)
CRISPR / Cas9編輯系統(tǒng)目前被廣泛應(yīng)用于在hPSCs（多能干細胞）的特定基因中產(chǎn)生突變，以此模擬體外遺傳疾病的細胞模型。轉(zhuǎn)染后的混合細胞群同時包含未編輯和各種編輯的細胞，需要通過手動稀釋克隆進行分離，這個過程既費時又費力，而且步驟繁瑣。
最近一篇文章[1]利用賽多利斯CellCelector Flex全自動無損細胞分離系統(tǒng)在CRISPR / Cas9基因編輯后，從混合細胞群中高效識別單細胞，并從這些分離的單細胞中精確分離單細胞克隆。那么，這個設(shè)備有什么秘密呢？
秘密1 納米孔板：讓細胞住上單間
24孔板中的每一個大孔都具有數(shù)千個方形納米孔（體積約為4 nL的微結(jié)構(gòu)）。在這種設(shè)計下，納米孔的存在可以增加孔內(nèi)的細胞密度，同時確保單個細胞能通過納米孔壁有效地分離。這使得數(shù)幾千個細胞能夠在同一大孔中共培養(yǎng)，同時保持其單克隆性，并且擁有更快的增殖速度。每個大孔只需要接種約1000-3000個細胞，接種細胞按照泊松分布隨機分布在納米孔中，因此，至少約30%的納米孔會被單細胞占據(jù)，從而大大提高單細胞的分離效率。
圖1. CellCelector Flex全自動無損細胞分離系統(tǒng)和24孔納米孔板：
A.每個納米孔形成一個正方形（200×200 μm），由100 μm高的壁界定；
B. 系統(tǒng)能自動拼接整個孔圖像并自動分割納米孔，在每個代表性孔中，軟件能通過分割識別2,263個方形納米孔，每個識別的納米孔都用紅線包圍，并分配一個唯一ID，以便在實驗中實現(xiàn)可追溯性；C. CellCelector Flex 概述：（a） 倒置熒光顯微鏡和電動載物臺;（b）終板工作臺和（c）帶有高精度玻璃毛細管的單細胞挑取機械臂（放大視角見圖D.）；
E. 系統(tǒng)俯視圖：平臺由專用區(qū)域組成，（a）源板工作臺（b）滅菌罐和（c）廢物容器
秘密2自動識別單克隆孔
為了驗證該系統(tǒng)識別、篩選和挑取hPSC克隆方面的能力，文中生成了兩個具有整合GFP或mCherry基因的hPSC細胞系，并將轉(zhuǎn)基因插入到腺相關(guān)病毒整合位點1（AAVS1）位點。以等比例混合無標(biāo)記，分別表達GFP和mCherry的hPSC，然后將它們接種到納米孔中。在D0（第0天），使用CellCelector Flex系統(tǒng)自動掃描接種了細胞的納米孔。然后使用CellCelector Flex軟件的特定圖像分析算法（包括設(shè)定單細胞大小和球形度等參數(shù)閾值）對D0的單細胞納米孔進行鑒定。在挑選前的第3-5天，我們再次掃描納米孔板，系統(tǒng)會根據(jù)其生長自動選擇單細胞來源的細胞克隆團，并提供基于圖像的單克隆證明。文章使用CellCelector Flex玻璃毛細管挑頭對細胞克隆團進行挑取，并將其接種在96孔板中。在培養(yǎng)過程中，可以使用Incucyte® 實時活細胞分析系統(tǒng)跟蹤細胞的生長。
圖2. 單克隆細胞挑選示意圖
圖3.單克隆自動識別示意圖：
左右圖分別展示了D0和D4的同一位置納米孔，只有當(dāng)D0是單克隆并且在D4有細胞增殖的納米孔才會被自動識別和挑取
圖4. 自動分離納米孔中的單細胞克隆：
A. 單細胞來源的hPSC克隆自動分離的示意圖，在將單細胞接種到納米孔板和自動克隆挑取之前，將混合的無標(biāo)記、mCherry 和 GFP 標(biāo)記的 hiPSC 群體 （1：1：1） 混合；
B. 無標(biāo)記hiPSC、GFP-hiPSC和mCherry-hiPSCs的代表性圖像，分別在第0天（D0） a）納米孔內(nèi)培養(yǎng)3天（D3）（b）以及由CellCelecto Flex的自動機械臂挑取前（c）后（d）作為單細胞接種，選擇的細胞克隆團在面板（c）和（d）中用虛線突出顯示，挑取后，將細胞克隆團接種到96孔板中，然后在D5，D10和D18（e，f，g）處成像
秘密3 溫和挑取細胞，無交叉污染
文章中作者還探究了單細胞挑取過程中大家最為關(guān)心的交叉污染問題。由于玻璃毛細管在每次取樣之間不會更換，設(shè)計實驗評估了使用同一毛細管連續(xù)取樣和接種細胞克隆團是否會導(dǎo)致交叉污染。連續(xù)挑取無標(biāo)記、GFP 或 mCherry 熒光的細胞克隆團并接種。細胞增殖后，在接種孔里沒有觀察到細胞克隆團的熒光顏色混合。因此，連續(xù)提取不同的細胞克隆團不會引起交叉污染。并且?guī)缀跛刑羧〗臃N后的培養(yǎng)孔里的細胞克隆團都進行了增殖，也說明挑取和接種不會影響細胞活性。
圖5. 對接種后的孔進行成像結(jié)果
文章最后用免疫熒光觀測和測序驗證了挑取后干細胞的多能性和基因整合度。
CellCelector與傳統(tǒng)挑取兩種方法的對比示意圖
傳統(tǒng)的手動挑選和培養(yǎng)條件，不僅操作繁瑣，效率低下，而且容易造成污染。CellCelector系統(tǒng)的單細胞分離方案能夠?qū)r間從傳統(tǒng)方法的7-9天縮短到3-4天，在基因編輯后能夠可靠地分析單細胞克隆，減少人工操作，減少培養(yǎng)皿數(shù)量，縮短實驗周期，提高可溯源性，從而高效地生成遺傳病或研究基因功能的hPSC。
這樣的系統(tǒng)，做干細胞的你怎能不愛？
《基于圖像的全自動干細胞克隆篩選及分離》
下載應(yīng)用手冊，了解如何使用CellCelector Flex全自動無損細胞分離系統(tǒng)，對干細胞集落進行高特異性、溫和的自動化轉(zhuǎn)移。
-參考文獻-
[1] Frank E, et al. Semi-automated optimized method to isolate CRISPR/Cas9 edited human pluripotent stem cell clones. Stem Cell Res Ther. 2023 Apr 27;14(1):110. doi: 10.1186/s13287-023-03327-2.