1 、獲取細胞或組織裂解物
1）根據檢測蛋白的位置選擇合適的裂解buffer；
2）選擇合適的蛋白酶抑制劑，避免蛋白降解，從而保證檢測的準確性。
2 、蛋白定量
3 、電泳分離蛋白質
4 、轉膜：根據不同的檢測目的和待測蛋白的特性,選擇合適的膜類型。
5 、封閉：去掉膜上多余的非特異性結合位點，降低背景。
6 、一抗孵育
一抗的選擇成功與否，是整個
WB實驗代測成功的關鍵，選擇一抗有以下幾個注意點：
1）選擇適合檢測標本種屬的一抗；
2）選擇適用于WB實驗方法的一抗；
3）選擇單克隆抗體或者經過親和純化的多克隆抗體。
7 、二抗孵育：孵育條件一般為室溫1-2小時。
8 、底物孵育：選擇顯色或者化學發光底物。一般傾向于化學發光，靈敏度高且背景低，節省抗體用量。
9 、結果分析和檢測：凝膠成像系統檢測或者暗室曝光到膠片。
