構(gòu)建背景：EPO 是調(diào)控紅細(xì)胞生成的關(guān)鍵細(xì)胞因子，該亞系克隆通過(guò)載體介導(dǎo)（如含 EF-1α 啟動(dòng)子的表達(dá)質(zhì)粒）將人 EPO 基因?qū)?CHO 細(xì)胞，經(jīng) G418 抗性篩選及單克隆純化獲得高表達(dá)株，“T" 代表篩選得到的穩(wěn)定分泌亞系，確保 EPO 產(chǎn)量與活性的均一性。

形態(tài)與增殖：體外培養(yǎng)呈典型上皮樣形態(tài)，貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞呈多邊形，排列緊密，形態(tài)與親本 CHO 細(xì)胞一致。在 37℃、5% CO?條件下，傳代周期約 2-3 天，可適應(yīng)含 10% 胎牛血清的 DMEM/F12 培養(yǎng)基，兼容懸浮培養(yǎng)與無(wú)血清體系，高密度培養(yǎng)（細(xì)胞密度達(dá) 1.5×10?個(gè) /mL）時(shí)仍能維持穩(wěn)定增殖，為大規(guī)模生產(chǎn) EPO 奠定基礎(chǔ)。

表達(dá)特征：EPO 主要分泌至細(xì)胞外培養(yǎng)基，表達(dá)量可達(dá) 8-12μg/（10?細(xì)胞?24h），長(zhǎng)期傳代（＞40 代）后分泌量波動(dòng)＜10%。分泌的 EPO 為糖基化蛋白，分子量約 34kDa（含 30%-40% 糖鏈），與天然人 EPO 的糖型分布高度一致，通過(guò) Western blot 可檢測(cè)到特異性條帶，且能被 EPO 抗體中和，體外刺激紅系祖細(xì)胞增殖的活性是原核表達(dá)產(chǎn)物的 5-8 倍。

優(yōu)勢(shì)：EPO 分泌穩(wěn)定，避免重組蛋白表達(dá)的批次差異；糖基化修飾與天然 EPO 一致，體內(nèi)半衰期（約 8-12 小時(shí)）接近天然蛋白，生物活性顯著優(yōu)于原核或酵母表達(dá)系統(tǒng)；培養(yǎng)適應(yīng)性強(qiáng)，可通過(guò)懸浮培養(yǎng)放大至生物反應(yīng)器生產(chǎn)，降低大規(guī)模制備成本；分泌型表達(dá)便于產(chǎn)物純化，無(wú)需裂解細(xì)胞，簡(jiǎn)化下游處理流程。

局限性：長(zhǎng)期培養(yǎng)需維持 G418 篩選壓力（通常 500μg/mL），否則易丟失表達(dá)質(zhì)粒；EPO 分泌受細(xì)胞密度與代謝狀態(tài)影響，需優(yōu)化培養(yǎng)條件（如控制葡萄糖濃度）以保持產(chǎn)量穩(wěn)定；作為異源表達(dá)系統(tǒng)，糖鏈末端唾液酸含量略低于人源細(xì)胞，雖不影響主要活性，但用于臨床級(jí)藥物生產(chǎn)時(shí)需進(jìn)一步優(yōu)化。

培養(yǎng)條件：基礎(chǔ)培養(yǎng)基為含 10% 胎牛血清、500μg/mL G418 的 DMEM/F12，添加青mei素 - 鏈mei素防污染。傳代時(shí)用 0.25% yi酶消化，貼壁培養(yǎng)融合度控制在 60%-80%，避免過(guò)度密集導(dǎo)致 EPO 分泌量下降。懸浮培養(yǎng)可采用無(wú)血清培養(yǎng)基（如 CHO-S-SFM II），通過(guò)生物反應(yīng)器實(shí)現(xiàn)規(guī)模化生產(chǎn)，EPO 產(chǎn)量可達(dá) 30-50mg/L。

EPO 活性檢測(cè)：推薦使用 TF-1 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證活性，將培養(yǎng)上清與 TF-1 細(xì)胞共孵育 48 小時(shí)，通過(guò) CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞活力，活性單位定義為刺激 50% 最大增殖的上清稀釋倍數(shù)，通常比活性＞1.5×10?U/mg。

凍存與復(fù)蘇：凍存液含 10% DMSO、500μg/mL G418，液氮保存可維持活性 5 年以上；復(fù)蘇時(shí) 37℃快速解凍，離心后用含篩選壓力的培養(yǎng)基重懸，傳代 2 次后檢測(cè) EPO 分泌量，確保活性穩(wěn)定。