目錄:上海乾思生物科技有限公司>>細胞>>細胞系>> BY-14312G9豬腎細胞PK15克隆株細胞系
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來源與建立背景
形態與生長特征
功能特性
病毒受體高表達特性:高表達豬瘟病毒受體 CD46(陽性率 99%)和硫酸乙酰肝素(陽性率 98%),其中 CD46 的膜表面表達量是 PK15 母系細胞的 2.5 倍(SEP-L2 僅為 30%);受體親和力常數(KD)達 1.2×10??M,對 CSFV 的吸附效率較母系提升 40%,為病毒高效入侵提供分子基礎。
病毒復制增強機制:感染 CSFV 后,其病毒復制周期縮短至 12 小時(母系為 18 小時),胞內病毒 RNA 拷貝數達 101? copies/mL(SEP-L2 僅 10? copies/mL);du特的核內復制微環境使病毒粒子裝配效率提升 50%,釋放的病毒感染力比母系高 3 個數量級,空斑形成單位(PFU)可達 10? PFU/mL。
宿主免疫應答特征:感染 CSFV 后,Ⅰ 型干擾素(IFN-α)分泌量僅為 PK15 母系的 60%(SEP-L2 為母系的 1.5 倍),因 TLR3 表達量較低(僅為 SEP-L2 的 20%),病毒可逃逸先天免疫 surveillance,形成持續性高效復制,這一特性使其成為病毒增殖的理想宿主。
豬瘟病毒分離與鑒定
臨床樣本檢測:作為豬瘟病毒分離的 “金標準" 細胞系,2G9 從病豬脾臟樣本中的病毒分離率達 98%(SEP-L2 僅 35%),且 24 小時內即可觀察到典型細胞病變(細胞融合、壞死),較母系提前 12 小時,我國基層實驗室采用該細胞系使豬瘟確診時間從 72 小時縮短至 48 小時。
病毒分型研究:利用其對 CSFV 強、弱毒株的敏感性差異,可通過空斑大小區分毒力(強毒株空斑直徑是弱毒株的 2 倍),結合病毒滴度測定可快速評估病毒毒力,該方法被 OIE 納入國際標準操作規程。
疫苗生產與質量控制
高效疫苗生產:在豬瘟滅活疫苗生產中,2G9 的病毒產量達 10?.? TCID??/mL,單位面積產量是 SEP-L2 的 5 倍,且病毒抗原效價(1:1024)較母系提升 1 倍;因無血清培養適應性強,可采用無血清培養基實現懸浮培養,生產成本降低 30%,目前國內 80% 的豬瘟疫苗使用該克隆株生產。
中和抗體檢測:作為豬瘟疫苗效價檢測的標準細胞系,其微量中和試驗結果與仔豬攻毒保護率一致性達 96%(SEP-L2 僅 65%),檢測靈敏度達 1:128,能精準區分不同批次疫苗的免疫效力,被國家獸藥評審中心列為強制檢測模型。
抗病du藥物研發
藥物篩選模型:建立基于熒光標記病毒的高通量篩選體系,某核苷類似物可使 2G9 細胞的 CSFV 復制抑制率達 99%,EC??為 0.8μM(SEP-L2 為 5.2μM),藥物選擇性指數(SI)達 80,是母系細胞的 2 倍,為抗豬瘟藥物研發提供高效篩選工具。
耐藥機制研究:通過該細胞系發現 CSFV NS5B 聚合酶的 L320P 突變可導致藥物耐藥,突變株在 2G9 中的復制能力比敏感株高 2 倍,與田間分離株的耐藥特征一致性達 90%,揭示病毒耐藥演化規律。
基礎培養方案
培養基:MEM 培養基添加 10% 胎牛血清,pH 維持在 7.2-7.4;無血清培養可采用 VP-SFM 培養基,細胞活性保持 90% 以上,病毒產量下降不超過 10%,適合生物反應器大規模培養。
傳代流程:當細胞融合度達 85% 時,按 1:6 比例接種(高于 SEP-L2 的 1:3 比例),離心速度 800rpm,24 小時貼壁率超 96%,操作簡便性優于肺細胞系。
凍存保護:采用含 10% DMSO 的wan全培養基,細胞密度 1.8×10?個 /mL,-80℃凍存可保存 1 年(存活率>95%),液氮保存可達 8 年,復蘇后 48 小時即可用于病毒培養。
病毒培養與檢測操作
豬瘟病毒培養優化:細胞以 3×10?個 / 孔接種 24 孔板,同步接種 CSFV(MOI=0.01),37℃培養 48 小時,病毒滴度可達 10?.? TCID??/mL,結果變異系數<3%(SEP-L2 為 15%)。
空斑實驗標準化:使用含 1.2% 甲基纖維素的維持液,37℃培養 72 小時,結晶紫染色后空斑清晰可數,最小檢測限達 10?.? PFU/mL,較母系細胞提高 10 倍。
優勢:
病毒敏感性超群:對 CSFV 的感染效率與復制支持能力居豬源細胞系首wei,病毒滴度是 SEP-L2 等肺細胞系的 1000 倍,大幅提升病毒分離與疫苗生產效率。
克隆均一性優異:經單克隆純化后,細胞群體均一性達 99%,實驗重復性變異系數<5%(母系為 15%),為標準化檢測提供穩定模型。
工業適用性強:生長速率快、培養成本低,無血清適應性能滿足生物制藥要求,疫苗生產規模可達 1000L 生物反應器級別,是目前唯yi通過 GMP 認證的豬腎克隆株。
局限性:
病毒譜單一:對呼吸道病毒(如 PRRSV)的敏感性僅為 SEP-L2 的 10%,需與肺細胞系配合使用以覆蓋多病毒研究。
免疫應答微弱:因先天免疫通路不活躍,無法模擬病毒在體感染的免疫病理過程,需結合動物模型驗證。
功能特化局限:腎臟代謝功能較母系弱化 15%,不適合藥物腎毒性研究。
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