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技術文章

質粒載體構建的步驟

閱讀:40          發布時間:2025-7-22
  質粒載體構建的步驟:
 
  載體選擇與設計:
 
  根據研究需求選擇合適的質粒載體,考慮其多克隆位點、抗生素抗性標記、復制子和啟動子等元素。
 
  設計插入片段,確認需要插入的基因序列,并選擇合適的啟動子和終止子以確保基因能夠有效表達。
 
  目的片段獲取:
 
  目標基因可以通過PCR擴增、化學合成或從現有質粒/基因組中提取等方式獲得。
 
  若通過PCR擴增獲取目的片段,需設計特異性引物,并在引物兩端添加合適的酶切位點以便后續插入載體。
 
  載體與目的片段處理:
 
  使用限制性內切酶對質粒載體進行酶切,形成插入基因所需的粘性端或平端。
 
  同樣使用合適的酶對目標基因進行酶切,確保切割產生的端與載體匹配以便連接。
 
  連接反應:
 
  將載體和插入片段按一定摩爾比混合,加入T4 DNA連接酶(或其他連接酶),并設定適當的反應條件(如溫度、時間)進行連接。
 
  連接效率受載體與片段投入量、反應時間等因素影響,需進行條件優化。
 
  轉化與篩選:
 
  將連接后的質粒導入感受態細胞(如大腸桿菌DH5α)中,通過熱擊法或電擊法實現轉化。
 
  將轉化的細胞接種到含有抗生素的培養基上,通過抗生素抗性篩選出攜帶重組質粒的菌落。
 
  陽性克隆鑒定:
 
  對篩選出的菌落進行菌落PCR或酶切鑒定,驗證插入片段的正確性。
 
  若需要進一步確認序列正確性,可將質粒送去測序。

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