Ginsenoside Rb1 prevents age-related endothelial senescence by modulating SIRT1/caveolin-1/enos signaling pathway

Keywords: Ginsenoside Rb1, Senescence, Caveolin-1, Deacetylation, Human umbilical vein endothelial cells

隨著老齡化問題的加劇，動脈粥樣硬化發(fā)病率逐年上升，而個體衰老伴隨的細(xì)胞衰老尤其是血管內(nèi)皮細(xì)胞衰老，已被證實(shí)是動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素，且減輕內(nèi)皮細(xì)胞衰老可顯著改善病情。因此，深入探究內(nèi)皮細(xì)胞衰老機(jī)制并尋找抗衰老藥物，對開發(fā)心血管疾病新療法、降低疾病負(fù)擔(dān)具有重要意義。內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）作為合成一氧化氮（NO）的限速酶，其激活后產(chǎn)生的 NO 可延緩內(nèi)皮細(xì)胞衰老并預(yù)防動脈粥樣硬化，但小窩蛋白- 1（caveolin-1）與 eNOS 結(jié)合抑制其活性的具體機(jī)制尚未闡明，這仍是該領(lǐng)域的研究重點(diǎn)之一。

Caveolin-1 作為細(xì)胞膜小窩的主要成分，可與細(xì)胞骨架蛋白間接相連維持小窩內(nèi)陷結(jié)構(gòu)，并通過結(jié)合內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）抑制其活性，在衰老的內(nèi)皮細(xì)胞中，Caveolin-1 表達(dá)增加而 eNOS 活性降低，其轉(zhuǎn)運(yùn)及結(jié)合能力影響 eNOS 介導(dǎo)的 NO 生成。Caveolin-1 的表達(dá)及 eNOS 的去乙酰化水平受去乙酰化酶 SIRT1 調(diào)控，SIRT1 與延緩衰老密切相關(guān)，但其是否通過影響 Caveolin-1 調(diào)節(jié) eNOS 功能尚不明確。人參作為傳統(tǒng)抗衰老中藥，其主要成分人參皂苷 Rb1（G-Rb1）對血管內(nèi)皮細(xì)胞有保護(hù)作用，可增強(qiáng) eNOS 活性、延緩內(nèi)皮細(xì)胞衰老，或與 SIRT1 有關(guān)。

基于此，廣州中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院的研究團(tuán)隊(duì)通過建立人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞復(fù)制性衰老模型，探究 G-Rb1 是否通過 SIRT1 影響 Caveolin-1/eNOS 軸，最終明確了 SIRT1 對 Caveolin/eNOS 軸的調(diào)控作用，揭示 Caveolin 乙酰化水平對 eNOS 活性的影響，為抗動脈粥樣硬化的抗衰老治療提供新靶點(diǎn)和理論基礎(chǔ)。研究結(jié)果發(fā)表在Heliyon 期刊題為“Ginsenoside Rb1 prevents age-related endothelial senescence by modulating SIRT1/caveolin-1/enos signaling pathway"。

首先，研究人員通過提取并傳代原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs），成功建立了復(fù)制性衰老模型。提取后的原代 HUVECs 經(jīng)形態(tài)學(xué)（鋪路石樣外觀）和 CD31 高表達(dá)驗(yàn)證后確認(rèn)細(xì)胞類型（圖 1A 和 B）。隨著傳代進(jìn)行，第 16 代細(xì)胞出現(xiàn)增殖速度明顯減緩、形態(tài)變得不規(guī)則的現(xiàn)象（圖 1C），β- 半乳糖苷酶染色陽性細(xì)胞比例顯著上升（圖 1D）。同時內(nèi)皮細(xì)胞衰老標(biāo)志物 PAI-1 的表達(dá)水平也從第 16 代開始顯著升高（圖 1E）。這些結(jié)果表明第 16 代細(xì)胞穩(wěn)定呈現(xiàn)衰老特征，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)將第 16 代細(xì)胞認(rèn)定為衰老細(xì)胞，第 2 代細(xì)胞作為年輕細(xì)胞對照。

圖1    衰老的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的鑒定。

接下來，為了探究 G-Rb1 對內(nèi)皮細(xì)胞衰老的影響，基于前期研究，設(shè)置了 0 μmol/L 至 120 μmol/L 共 6 個濃度梯度的 G-Rb1 處理衰老的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，120 μmol/L 的 G-Rb1 可能對細(xì)胞有害（圖 2A）。而通過檢測 PAI-1 表達(dá)水平和 β- 半乳糖苷酶陽性細(xì)胞比例，證實(shí) 80 μmol/L 的 G-Rb1 能夠顯著減輕細(xì)胞的復(fù)制性衰老（圖 2B 和 C）。由此確定，后續(xù)實(shí)驗(yàn)將采用 80 μmol/L 作為 G-Rb1 的實(shí)驗(yàn)濃度。

圖 2   人參皂苷 Rb1 在血管內(nèi)皮細(xì)胞抗衰老中的作用。

研究發(fā)現(xiàn)，衰老細(xì)胞中 SIRT1 和 eNOS 的 mRNA 及蛋白水平低于年輕細(xì)胞，而Caveolin-1 的表達(dá)情況則相反，G-Rb1 能夠改善這一現(xiàn)象（圖 3A 和 B）。同時，G-Rb1 還能減少衰老細(xì)胞中 NO 水平的降低（圖 3C）。此外，通過 siRNA 調(diào)節(jié) SIRT1 和Caveolin-1 的表達(dá)實(shí)驗(yàn)表明，SIRT1 表達(dá)下降、Caveolin-1 表達(dá)上升會加劇細(xì)胞衰老（圖 3D 和 E），證實(shí)了 SIRT1 和Caveolin-1 在細(xì)胞衰老進(jìn)程中具有關(guān)鍵作用。

圖3    人參皂苷 Rb1 在血管內(nèi)皮細(xì)胞抗衰老中的作用。

最后，為進(jìn)一步確認(rèn) SIRT1/caveolin-1/eNOS 在 G-Rb1 抗衰老特性中的作用并探究其潛在機(jī)制，研究人員通過 siRNA 干擾抑制 HUVECs 中 SIRT1 和 caveolin-1 表達(dá)，再用 G-Rb1 處理細(xì)胞，檢測相關(guān)蛋白和 mRNA 表達(dá)。結(jié)果顯示，抑制 SIRT1 可抵消 G-Rb1 對 eNOS 的上調(diào)作用，但僅部分削弱 G-Rb1 的抗衰老效果（圖 4A 和 B）；抑制 caveolin-1 不影響 G-Rb1 對 eNOS 的上調(diào)，卻能增強(qiáng)G-Rb1 的 抗衰老作用（圖 4A 和 B），證實(shí) SIRT1/caveolin-1/eNOS 通路調(diào)節(jié)對 G-Rb1 抗細(xì)胞衰老十分關(guān)鍵。此外，抑制 SIRT1 不能消除 G-Rb1 對 NO 表達(dá)的影響，抑制 caveolin-1 還能進(jìn)一步提升 NO 表達(dá)，表明 G-Rb1 或通過其他機(jī)制影響 eNOS 活性（圖 4C）。

圖4    人參皂苷 Rb1 通過 SIRT1/caveolin-1 調(diào)控 eNOS 的活性。

研究發(fā)現(xiàn)，G-Rb1 能夠顯著降低 caveolin-1 和 eNOS 的乙酰化程度，然而當(dāng) SIRT1 基因被沉默后，G-Rb1 的這種降低乙酰化作用被逆轉(zhuǎn)（圖 4D）。在 caveolin-1 基因沉默的情況下，乙酰化的 caveolin-1 和 eNOS 水平本身已下降，而 G-Rb1 進(jìn)一步增強(qiáng)了這一效應(yīng)（圖 4D 和 E）。這些結(jié)果表明，G-Rb1 是通過調(diào)控 SIRT1/caveolin-1/eNOS 信號通路的表達(dá)水平與乙酰化水平，實(shí)現(xiàn)其抗衰老的功效。

圖5    人參皂苷 Rb1 對 SIRT1/caveolin-1/eNOS 軸的調(diào)控作用。

總之，本研究證實(shí)了G-Rb1 在延緩人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞衰老方面具有顯著效果。通過以 SA-β-GAL、PAI-1 和 NO 作為細(xì)胞衰老標(biāo)志物開展體外實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn) G-Rb1 能夠有效改善衰老細(xì)胞功能。研究進(jìn)一步揭示，G-Rb1 發(fā)揮作用的靶點(diǎn)與 SIRT1/caveolin-1/eNOS 軸密切相關(guān)。具體而言，一方面 SIRT1 可通過調(diào)控 caveolin-1 和 eNOS 的表達(dá)及乙酰化水平，延緩血管內(nèi)皮細(xì)胞的復(fù)制性衰老；另一方面，G-Rb1 正是通過作用于 SIRT1/caveolin-1/eNOS 軸，實(shí)現(xiàn)對血管內(nèi)皮細(xì)胞復(fù)制性衰老的緩解（圖 5）。

參考文獻(xiàn)：Zhou B, Sh G, Xie D, Zhao X, Hao B, Liu D, Wang M, Wu L, Lin L, Qian X. Ginsenoside Rb1 prevents age-related endothelial senescence by modulating SIRT1/caveolin-1/enos signaling pathway. Heliyon. 2024 Jan 17;10(3):e24586. doi: 10.1016/j.heliyon.2024.e24586. PMID: 38322899; PMCID: PMC10844051.

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