溫度
梯度PCR是指在退火溫度不太明確時，為了找到*退火溫度，在一臺
PCR儀上同時做多管PCR，每一管放在儀器內不同列（有的是不同行）上，分別進行PCR（如50℃~60℃可以分6管，分別為50，52，54，56，58，60度），zui后看看哪個溫度的效果。總之是用來進行退火溫度優化的。
降落PCR是在同一個PCR管內進行PCR，只是每個循環的溫度不同（如每個循環降1度）。一般兼并引物用這種方法多些。
設計多循環反應的程序，以使相連循環的退火溫度越來越低。由于開始時的退火溫度選擇為高于估計的Tm值，隨著循環的進行，退火溫度逐漸降到Tm值，并zui終低于這個水平，用于確保*個引物—模板雜交事件發生在zui互補的反應物之間，即那些產生目的擴增產物的反應物之間。盡管退火溫度zui終會降到非特異雜交的Tm值，但此時目的擴增產物已開始幾何擴增，在剩下的循環中處于*滯后（非特異）PCR產物的地位。由于目標是在較早的循環中避免低Tm值配對，在TD—PCR中應用熱啟動技術。設計時，退火溫度的范圍應跨越15℃左右，從高于估計Tm值至少幾度到低于它10℃。例：一對沒有簡并的引物—模板的計算Tm值為62℃。則：從65℃—>50℃（每2cycles降退火溫度1℃），再在50℃退火溫度下做15個循環。實驗中如持續出現假象帶（雜帶），則是因為起始退火溫度太低，或目的擴增產物和非目的產物的Tm值相差無幾，或非目的擴增物以更高的擴增效率擴增，可把退火溫度每降低1℃所需的循環數增加到3或4。
