日常科研三件套

文獻、實驗和文章

白天做實驗，晚上看文獻

相信各位老師在做實驗的時候會遇到各種各樣的問題

今天我們就來講講免疫熒光實驗中

遇到的各種各樣的問題，

包括它的概念和原理等等，，，

免疫熒光（IF）是什么

免疫熒光技術(shù)（Immunofluorescence technique ）又稱熒光抗體技術(shù)，是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展最早的一種。它是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一項技術(shù)。很早以來就有一些學(xué)者試圖將抗體分子與一些示蹤物質(zhì)結(jié)合，利用抗原抗體反應(yīng)進行組織或細胞內(nèi)抗原物質(zhì)的定位。

免疫熒光（IF）的原理

免疫學(xué)的基本反應(yīng)是抗原-抗體反應(yīng)。由于抗原抗體反應(yīng)具有高度的特異性，所以當(dāng)抗原抗體發(fā)生反應(yīng)時，只要知道其中的一個因素，就可以查出另一個因素。免疫熒光技術(shù)就是將不影響抗原抗體活性的熒光色素標(biāo)記在抗體（或抗原）上，與其相應(yīng)的抗原（或抗體）結(jié)合后，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)一種特異性熒光反應(yīng)。

直接法

間接法

如檢查未知抗原，先用已知未標(biāo)記的特異抗體（第一抗體）與抗原標(biāo)本進行反應(yīng)，用水洗去未反應(yīng)的抗體，再用標(biāo)記的抗抗體（第二抗體）與抗原標(biāo)本反應(yīng)，使之形成抗體—抗原—抗體復(fù)合物，再用水洗去未反應(yīng)的標(biāo)記抗體，干燥、封片后鏡檢。如果檢查未知抗體，則表明抗原標(biāo)本是已知的，待檢血清為第一抗體，其它步驟的抗原檢查相同。標(biāo)記的抗抗體是抗球蛋白抗體，同于血清球蛋白有種的特異性，如免疫抗雞血清球蛋白只對雞的球蛋白發(fā)生反應(yīng)，因此，制備標(biāo)記抗體適用于任何抗原的診斷。

應(yīng)用范圍

其應(yīng)用范圍極其廣泛，可以測定內(nèi)分泌激素、蛋白質(zhì)、多肽、核酸、神經(jīng)遞質(zhì)、受體、細胞因子、細胞表面抗原、腫瘤標(biāo)志物、血藥濃度等各種生物活性物質(zhì)。根據(jù)診斷類別，又可分為傳染性疾病、內(nèi)分泌、腫瘤、藥物檢測、免疫學(xué)、血型鑒定等。

基本實驗操作步驟

（1） 細胞準(zhǔn)備。對單層生長細胞，在傳代培養(yǎng)時，將細胞接種到預(yù)先放置有處理過的蓋玻片的培養(yǎng)皿中，待細胞接近長成單層后取出蓋玻片，PBS洗兩次；對懸浮生長細胞，取對數(shù)生長細胞，用PBS離心洗滌（1000rpm,5min）2次，用細胞離心甩片機制備細胞片或直接制備細胞涂片。

（2） 固定。根據(jù)需要選擇適當(dāng)?shù)墓潭▌┕潭毎９潭ㄍ戤吅蟮募毎芍糜诤B氮納的PBS中4℃保存3個月。PBS洗滌3×5 min.

（3） 通透。使用交聯(lián)劑（如多聚甲醛）固定后的細胞，一般需要在加入抗體孵育前，對細胞進行通透處理，以保證抗體能夠到達抗原部位。選擇通透劑應(yīng)充分考慮抗原蛋白的性質(zhì)。通透的時間一般在5-15min.通透后用PBS洗滌3×5 min.

（4） 封閉。使用封閉液對細胞進行封閉，時間一般為30min.

（5） 一抗結(jié)合。室溫孵育1h或者4℃過夜。PBST漂洗3次，每次沖洗5min.

（6） 二抗結(jié)合。間接免疫熒光需要使用二抗。室溫避光孵育1h.PBST漂洗3次，每次沖洗5min后，再用蒸餾水漂洗一次。

（7） 封片及檢測。滴加封片劑一滴，封片，熒光顯微鏡檢查。

注意事項

1、染完之后沒有封片前直接照一 些，因為有的時候可能封片會出現(xiàn)問題，再想照反而沒有了，另外不要拖太長時間，熒光會崔滅的。

2、熒光的片子定要避光保存， 保存的好的話,過一段時間仍然能照出很好的片子。

3、二抗用之前一定離心，不然有的時候有那種沉淀，在片子上就是一個很大的非特異性熒光光點，非常難看。

4、整個操作在4°C下進行，洗滌液中加有比常規(guī)防腐劑量高1 0倍的NaN3，上述實驗條件是防止一抗結(jié)合細胞膜抗原后發(fā)生交聯(lián)、脫落。

5、洗滌要充分,以避免游離抗體封閉二抗與細胞膜上一抗相結(jié)合，出現(xiàn)假陰性。

6、加適量正常兔血清可封閉某些細胞表面免疫球蛋白F受體,降低和防止非特異性染色。

7、細胞活性要好，否則易發(fā)生非特異性熒光染色。抗淬滅劑可拿來直接封片,20微升即可,之后片子可保留更長時間。