豬戊型肝炎間接ELISA診斷試劑盒的研制

戊型肝炎(Hepatitis E,HE)是由戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)感染引起的一種急性、自限性疾病。病毒通過糞-口途徑進(jìn)行傳播,其爆發(fā)和流行主要分布在發(fā)展中國家,常因飲用水被污染而引起,散發(fā)病 例呈分布。1997年,*株動(dòng)物源性HEV—豬HEV的發(fā)現(xiàn),揭開了動(dòng)物源性HEV研究的新篇章。其后,各發(fā)達(dá)國家及印度等國陸續(xù)都有豬HEV的相 關(guān)報(bào)道,明確提出HE為一種人畜共患病,已成為各國密切關(guān)注的公共衛(wèi)生問題。 本試驗(yàn)應(yīng)用RT-PCR技術(shù)從HEV陽性豬糞便中擴(kuò)增出ORF2的部分基因片斷,大小為681bp,將其克隆于pMD18-T載體經(jīng)測序分析。將該片段插 入pET-32a表達(dá)載體,轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21,經(jīng)0.2mM IPTG誘導(dǎo)得到融合表達(dá)蛋白,SDS-PAGE分析證明該分子量為45KD,命名為PET32a-p221。Western blot試驗(yàn)顯示PET32a-p221與HEV陽性血清發(fā)生反應(yīng),具有良好的抗原性。應(yīng)用PET32a-p221作為抗原,確定了zui適包被濃度為 6μg/mL,血清zui適稀釋度為1:100,作用時(shí)間為60min,酶標(biāo)抗體zui適稀釋度為1:4000,作用時(shí)間為60min,建立了HEV間接 ELISA診斷方法。該方法與豬傳染性胃腸炎病毒、豬圓環(huán)病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬偽狂犬病毒、豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒陽性血清不發(fā)生交叉反 應(yīng),具有良好的特異性。批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)變異系數(shù)小于10%,批間重復(fù)試驗(yàn)變異系數(shù)小于15%,說明具有很好的重復(fù)性。用該方法檢測青海省人畜血清樣品結(jié)果顯 示,HEV感染率有顯著差異(x~2=38.78,P＜0.01),其中以豬感染率zui高為95.96%,其次家犬感染率為30%,在馬和雞中未檢出戊型肝 炎。同一種動(dòng)物HEV感染率在不同地區(qū)差異不顯著(x~2=5.78,P＞0.05)。該方法與萬泰公司雙抗原夾心ELISA診斷試劑在檢測人、馬、雞、 牛、豬戊型肝炎的符合率均為100%,而在家犬和山羊的符合率上存在差異,但不顯著。 本試驗(yàn)建立的豬戊型肝炎間接ELISA診斷方法通過實(shí)驗(yàn)室和現(xiàn)地應(yīng)用,表明該方法具有良好的特異性、敏感性,為我國豬戊型肝炎的防治與監(jiān)測提供了診斷技 術(shù)。