酶標儀實際上就是一臺變相光電比色計或分光光度計，其基本工作原理與主要結構和光電比色計基本相同.檢測原理介紹如下：
光是電磁波，波長100nm——400nm稱為紫外光，400nm——780nm之間的光可被人眼觀察到，大子780nm稱為紅外光。人們只所以能夠看到色彩，是因為光照射到物體上被物體反射回來。綠色植物之所以是綠色，是因為植物吸收了光中的紅色光譜。酶標儀測定的原理是在特定波長下，檢測被測物的吸光值。
檢測單位：
光通過被檢測物，前后的能量差異即是被檢測物吸收掉的能量，特定波長下，同一種被檢測物的濃度與被吸收的能量成定量關系。
檢測單位用OD值表示，OD是optical delnsity（光密度）的縮寫，表示被檢測物吸收掉的光密度， OD＝1og（1/trans），其中trans為檢測物的透光值。根據Bouger-amberT-beer法則，OD值與光強度成下述關系：
E＝OD=logΙ0/Ι其中E表示被吸收的光密度，Ι0為在檢測物之前的光強度，Ι為從被檢測物出來的光強度。
OD值由下述公式計算：
E＝OD=C×D×E
C為檢測物的濃度
D為檢測物的厚度
E為摩爾因子
在特定波長下測定每一種物質都有其特定的波長，在此波長下，此物質能夠吸收多的光能量。如果選擇其它的波長段，就會造成檢測結果的不準確。因此，在測定檢測物時，我們選擇特定的波長進行檢測，稱為測量波長。
但是每一種物質對光能量還存在一定的非特異性吸收，為了消除這種非特異性吸收，我們再選取一個參照波長，以消除這個不準確性。在參照波長下，檢測物光的吸收小。檢測波長和參照波長的吸光值之差可以消除非特異性吸收。
酶標儀檢測值計算
儀器中的檢測器接收透過被檢測物的光能量，轉換成二進位數字信號，大為4095。儀器定義沒有光源下的透光值為0%，沒有檢測物的透光值為100%。則實際檢測中，檢測物的透光值均在0%——100%之間。透光值的計算如下：
T＝（Meas-Min）/（Max-Min）
其中T為透光值，Meas為檢測的二進位數值，Min為在0%的情況下檢測的二進位數值，Max為在100%的情況下檢測的二進位數值，舉例如下：
Max=3600 Mn=20 Meas＝30
T=（30-20）/3600-20)＝0．0028
OD＝1og（1/T）=1og（1/0.0028）=2.552
